醫(yī)學(xué)論文范文:大鼠股骨骨不連模型不同位點骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因的表達(dá)

1.1 動物、試劑及儀器

健康SD大鼠35只,雌雄不限,體質(zhì)量約350g,由江蘇大學(xué)動物實驗中心提供,動物使用許可證:SCXK(蘇)2002��0045, 于本院中心實驗室動物房飼養(yǎng),光照晝夜交替,房間溫度20～26 ℃,濕度低于80%。異丙醇、無水乙醇、氯丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),Trizol(Invitrogen公司),DEPC水(上海生工生物工程有限公司),逆轉(zhuǎn)錄及RT�睷CR試劑盒(TaKaRa公司),高速離心機(Eppendolf centrifuge 5804�睷,德國),紫外分光光度計(Eppendolf Biophotometer,德國),RT�睵CR儀器(MX3000P real time PCR，美國Stratagene公司)。

1.2 方 法

1.2.1 動物模型的制作 精選體質(zhì)量、年齡都相當(dāng)?shù)拇笫?稱重后0.2%(0.2 ml/100 g)鹽酸氯胺酮腹腔注射,麻醉成功后固定大鼠于鼠板,備皮手術(shù)區(qū),消毒,沿肌間隙分離顯露左側(cè)股骨,于股骨干中部離斷一骨段,包括骨外膜,按骨髓腔直徑大小選擇相應(yīng)規(guī)格克氏針?biāo)枨粌?nèi)固定,造成5 mm股骨骨缺損,沖洗傷口,抗生素預(yù)防感染,逐層縫合至皮膚,右側(cè)股骨同樣按上述程序處理,但不做骨缺損而直接縫合傷口,后期取材作為正常對照以計算缺損區(qū)相對于正常骨組織的相對擴(kuò)增倍數(shù)。造模后大鼠置于鼠籠中自由活動,飼料正常喂養(yǎng),每天觀察活動和進(jìn)食情況至傷口愈合。

1.2.2 實驗分組 分為取材前35天、28天、21天、14天、7天、3天、1天7個時段,每個時段隨機選取5只SD大鼠造模,同一天處死取材。實驗組和對照組均標(biāo)記骨缺損中心區(qū)和外周區(qū)。

1.2.3 RNA的提取 取出凍存標(biāo)本組織,按標(biāo)記的外周區(qū)和中心區(qū)分別取材。中間缺損區(qū)域定為中心區(qū)(即缺損區(qū)域中心點向遠(yuǎn)近端各2.5 mm的范圍),中心區(qū)邊緣向遠(yuǎn)近端各5 mm定為邊緣區(qū)(即缺損區(qū)域中心點向遠(yuǎn)近端2.5～7.5 mm的范圍)。稱重約90 mg的組織置于無菌的研缽中,液氮研磨至粉末狀,按Trizol法提取總RNA,紫外分光光度計測光密度值,檢測各樣品中總RNA的含量及純度,-20 ℃保存醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。

1.2.4 引物設(shè)計 BMP��2基因:上游CGGAAGCGTCTTAAGTCCAG、下游CATGCCTTAGGGATTTTGGA;β�布�動蛋白基因:上游ATGTTTGAGACCTTCAACAC、下游CACGTCACACTTCATGG。

上述待測基因從基因庫中查出,引物由上海生工設(shè)計合成。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄 按照試劑盒說明書操作。

1.2.6 PCR反應(yīng) SYBR Green法,具體操作按照TaKaRa公司試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.7 結(jié)果計算 對照組SD大鼠股骨作為陽性對照,以去離子水作為陰性對照。所有樣本PCR反應(yīng)均做復(fù)孔,取其平均值作為結(jié)果。以公式2-△△CT計算骨缺損模型外周區(qū)及中心區(qū)BMP��2基因在相應(yīng)區(qū)域相對于正常骨組織的表達(dá)倍數(shù)[1]。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 利用統(tǒng)計軟件SPSS13.0。BMP��2在各個時段外周區(qū)和中心區(qū)的表達(dá)比較,采用獨立兩樣本t檢驗; BMP��2在外周區(qū)和中心區(qū)各個觀察時段的表達(dá)比較,用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

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