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人喉癌細(xì)胞COX-2基因真核表達(dá)載體醫(yī)學(xué)論文
1. 引言
Cyclooxygenase-2 （環(huán)氧化酶－2, COX-2) 是近幾年來(lái)引人注目、在多種惡性腫瘤當(dāng)中有高表達(dá)的基因， 這些腫瘤包括結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌和肝癌等。
COX-2 與腫瘤細(xì)胞的血管新生、凋亡、細(xì)胞循環(huán)周期、脂質(zhì)代謝均有著重要的關(guān)系， 是眾多非甾體類(lèi)藥物（Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) 如阿司匹林、布洛芬、吡洛西康等藥物的靶蛋白。環(huán)氧化酶（Cyclooxygenases,COXs) 是催化花生四烯酸（Arachidonic acid,AA) 轉(zhuǎn)化為前列腺素（Prosglandins, PG)的限速酶， 兩種COX 同功酶已經(jīng)被分離和界定：COX-1 和COX-2。它們有不同的編碼， 是有各自的特性的不同的基因。COX-1 在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中有基本的表達(dá)，而COX-2 主要是在炎癥狀態(tài)下和以下情形下被誘導(dǎo)表達(dá)而行使生物功能， 如生長(zhǎng)因子、有絲分裂、各種細(xì)胞素等。COXs 蛋白可以將花生四烯酸催化成各種PG 產(chǎn)物， PG 有各種亞型， 而其中PGE2 尤為重要。COX-2 是一個(gè)和多個(gè)腫瘤因子發(fā)生密切相聯(lián)系的蛋白質(zhì)。有越來(lái)越多的研究已經(jīng)證實(shí)COX2 蛋白在多方面參與腫瘤的形成過(guò)程， 文獻(xiàn)報(bào)道頭頸腫瘤能夠部檢出COX-2 的異常表達(dá)。鼻咽癌是我國(guó)部分地區(qū)發(fā)病率較高的頭頸腫瘤之一， 有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)COX-2 在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中也起著重要的作用；頭頸部腫瘤COX-2 的mRNA 水平是健康人正�？谇火つさ�150 倍。另有報(bào)道鱗狀細(xì)胞癌 （Squamous cell carcinoma, SCC) 包括咽鱗狀細(xì)胞癌中和喉鱗狀細(xì)胞癌中COX-2 都有過(guò)高的表達(dá)。喉鱗狀細(xì)胞癌 （laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC) 的高分化癌中COX-2 有較強(qiáng)的表達(dá)�？梢灶A(yù)示喉鱗狀細(xì)胞癌有不佳預(yù)后， 并警示的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子Epidermal growth factor receptor, EGFR)能刺激COX-2 的表達(dá)。國(guó)外有學(xué)者報(bào)道：COX-2 可以作為L(zhǎng)SCC 的一個(gè)治療攻擊靶向。國(guó)內(nèi)的研究學(xué)者也報(bào)道：COX-2 在LSCC 中起著一個(gè)重要的作用， 抑制它的表達(dá)可能對(duì)LSCC 的進(jìn)展有意義。有相當(dāng)多的證據(jù)證實(shí)規(guī)律地使用NSAIDs 能夠使這些腫瘤得到了遏制， 其機(jī)理主要是抑制生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡。關(guān)于COX -2的更詳細(xì)的功能、信號(hào)傳導(dǎo)和相關(guān)因素并非完全清楚。如最近有材料顯示在有些腫瘤當(dāng)中COX -2 能夠?qū)е耉EGF 的表達(dá)上調(diào)和抑制凋亡的。但是， 喉癌細(xì)胞或其他頭頸部腫瘤發(fā)生過(guò)程當(dāng)中COX -2 是否能刺激VEGF 的上調(diào)和腫瘤新生血管的生成以及能否抑制凋亡尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。諸如此類(lèi)問(wèn)題還有許多需要了解。因此深入探討COX-2 在頭頸部腫瘤的作用，對(duì)了解腫瘤發(fā)生的機(jī)理和以期將來(lái)在臨床上攻克腫瘤， 提供理論上依據(jù)是非常必要的。在本實(shí)驗(yàn)中， 我們構(gòu)建的重組COX-2 原核表達(dá)載體pCDNA3.1, 為研究該蛋白質(zhì)在頭頸部腫瘤細(xì)胞中對(duì)下游的靶蛋白的作用及相關(guān)的影響提供了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)條件。醫(yī)學(xué)全在.線www.gydjdsj.org.cn
2. 材料與方法
2.1 材料
本實(shí)驗(yàn)中所使用的人喉癌細(xì)胞hep-2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞室， dNTP、T4DNA Ligase （FL101)、T 載體（pT1 EASY-BLUNT SIMPLE CLONINGCB111, 3900bp)、大腸肝菌菌株是Ecoli DH5α 等均購(gòu)自北京全式金生物有限公司。限制性?xún)?nèi)切酶Hind III （Code No.:1060A, TaKaRa)， XbaI （Code No.:D1093A, TaKaRa) 購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。氨芐青霉素購(gòu)自上海生工公司。PCR 反應(yīng)中使用的Taq 酶是高保真DNA 聚合酶 （Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase, F-530S, New England Biolabs, Inc.)， 購(gòu)自NEB 公司中國(guó)分公司。RT-PCR 試劑盒購(gòu)自Fermentas 公司 （RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kits#K1621.Fermentas, Co. Ltd., Fermentas International inc. Canada)，使用的質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，pCDNA3.11（+) （Invitrogen. Co. Ltd. Catalog nos V790-20 and V795-20) 購(gòu)自Invitrogen.公司中國(guó)分公司。
