| 〈添加內(nèi)容〉 實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和使用細(xì)胞形態(tài)觀察 目的要求 1．熟悉普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和用途。 2．掌握低倍鏡、高倍鏡的正確使用方法。 材料用具 學(xué)生領(lǐng)用：顯微鏡、纖維片、蛙血涂片、貓脊神經(jīng)節(jié)片、小腸上皮橫切片 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一、錄像：光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和使用。 二、顯微鏡的構(gòu)造和使用。 (一)顯微鏡的構(gòu)造： 光學(xué)顯微鏡簡(jiǎn)稱光鏡，其作用是將微細(xì)結(jié)構(gòu)做適當(dāng)?shù)姆糯�，以便于觀察。因它是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、教學(xué)和科研的常用儀器，每個(gè)醫(yī)學(xué)生都必須熟悉它的結(jié)構(gòu)及其性能，掌握正確的操作要領(lǐng)。 普通光學(xué)顯微鏡種類很多，型號(hào)各不相同，無(wú)論外觀上存在著多大差異，但其基本結(jié)構(gòu)和功能大致是相同的，一般由機(jī)械部分和光學(xué)部分組成。(圖1—1)
1．機(jī)械部分： (1)鏡座：是顯微鏡的底座，呈馬蹄型，用以支持和穩(wěn)定整個(gè)顯微鏡。 (2)鏡柱：是垂直于鏡座上的短柱，起支持鏡臂和鏡臺(tái)的作用。 (3)鏡臂：位于鏡柱上面的弓型部分，便于提取。 (4)鏡筒：位于鏡臂前方的圓筒，上端裝有目鏡筒，下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器，它以齒狀板與 調(diào)節(jié)器相接，可上下移動(dòng)，調(diào)節(jié)焦距。 (5)傾斜關(guān)節(jié)：為鏡柱和鏡臂間的活動(dòng)關(guān)節(jié)，可使鏡臂在90度范圍內(nèi)做任意傾斜，以便 觀察。但一般在使用時(shí)傾斜角不超過(guò)30度。 (6)調(diào)節(jié)器：在鏡臂上方(有的位于下方)裝有一大一小兩對(duì)齒輪，大的為粗調(diào)節(jié)器，小的 為細(xì)調(diào)節(jié)器；轉(zhuǎn)動(dòng)它們可使鏡筒做上下移動(dòng)便于調(diào)節(jié)焦距。轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器可使鏡筒做較大 距離或較快速度的升降，通常在低倍鏡找物象時(shí)使用。轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器可使鏡筒做緩慢的升 降，常用它做精細(xì)的調(diào)節(jié)。從而得到清晰的物象。 (7)物鏡轉(zhuǎn)換器：位于鏡筒下端一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的圓盤，一般裝有3個(gè)不同放大倍數(shù)的接物 鏡，旋轉(zhuǎn)它可以調(diào)換不同放大倍數(shù)的接物鏡，旋轉(zhuǎn)盤邊緣有一固定卡，當(dāng)旋至物鏡和鏡筒成 直線時(shí)，就會(huì)發(fā)出“卡”的碰響聲，此時(shí)可調(diào)節(jié)焦距觀察玻片標(biāo)本。 (8)鏡臺(tái)：又稱載物臺(tái)，是位于鏡臂下前方的一塊方形平板(有的為圓形)，用于承放玻片 標(biāo)本，鏡臺(tái)中央有一圓形的通光孔，光線透過(guò)聚光鏡由此孔射向標(biāo)本。 (9)推進(jìn)器：位于鏡臺(tái)后方和側(cè)面邊緣，上方一側(cè)有兩個(gè)旋鈕，轉(zhuǎn)動(dòng)它可以調(diào)節(jié)推進(jìn)器，使標(biāo)本做前、后、左、右移動(dòng)以便全面觀察，有的顯微鏡無(wú)推進(jìn)器，但裝有彈簧夾，標(biāo)本推進(jìn)器上有縱橫游標(biāo)尺用以測(cè)定標(biāo)本在視野中的位置。游標(biāo)尺副標(biāo)尺的一致點(diǎn)。如圖1—2所示�？梢�(jiàn)副標(biāo)尺的零點(diǎn)在主標(biāo)尺的26—27之間，副標(biāo)尺的6與主標(biāo)尺的32一致，即6與主標(biāo)尺上的一個(gè)分度線正對(duì)，此標(biāo)尺所表示的數(shù)值即為26.6mm 2．光學(xué)部分： (1)反光鏡：位于聚光器下方，鏡柱前方的一個(gè)圓形平凹兩面鏡。反光鏡可轉(zhuǎn)向各方，以便收集各方向的光源，并反射到聚光鏡上。 反光鏡分平面鏡和凹面鏡兩種： 平面鏡：聚光力弱，適合光線較強(qiáng)時(shí)用。 凹面鏡：聚光力強(qiáng)，適合光線較弱時(shí)用，因此實(shí)驗(yàn)室常用凹面鏡。 (2)聚光器：位于鏡臺(tái)通光孔的下方，由聚光鏡和虹彩光圈組成。鏡柱的一側(cè)裝有螺旋，可調(diào)節(jié)聚光器的升降。上升時(shí)光線較強(qiáng)，下降時(shí)光較弱。 聚光鏡：由幾組透鏡組成，位于鏡臺(tái)下方，其作用是聚集光線，增強(qiáng)視野的亮度。 虹采光圈：又稱光闌，是由許多可活動(dòng)的金屬薄片疊合而成的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，圓環(huán)外側(cè)有一小柄，移動(dòng)小柄可使光圈打開或關(guān)閉，以控制光線的強(qiáng)弱，使物象更清晰。 (3)物鏡：嵌裝在旋轉(zhuǎn)盤上，一般分低倍鏡、高倍鏡和油鏡三種。低倍鏡頭最短，油鏡頭最長(zhǎng)，高鏡頭介于兩者之間。鏡頭上標(biāo)有不同放大倍數(shù)的符號(hào)，一般低倍鏡頭為5X，高倍鏡頭為40X，油鏡頭為100X，數(shù)字愈大其代表的放大倍數(shù)也就愈大。 (4)目鏡：裝在鏡筒的上端，一般鏡箱中配有幾種不同放大倍數(shù)的目鏡頭，使用時(shí)可根據(jù)自己的需要，選擇合適的目鏡頭裝于鏡筒中。目鏡內(nèi)常裝有一根指針，以示觀察玻片標(biāo)本的某一部分。 3．顯微鏡放大倍數(shù)的計(jì)算： 顯微鏡放大倍數(shù)二目鏡放大倍數(shù)X物鏡放大倍數(shù)，如：目鏡10X、物鏡40X，其放大倍數(shù)為10X40：400倍。 (二)顯微鏡的使用： 從鏡箱中取出顯微鏡時(shí)應(yīng)右手握鏡臂，左手托鏡座。把顯微鏡放在身前稍左側(cè)的實(shí)驗(yàn)桌上，座位高低要適宜，姿勢(shì)要端正，鏡座與桌邊距離約2寸。觀察顯微鏡標(biāo)本時(shí)要學(xué)會(huì)兩手同用(一手轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)器，一手轉(zhuǎn)動(dòng)推進(jìn)器)，兩眼齊睜，左眼觀察目鏡標(biāo)本。 1．低倍鏡的使用： (1)先轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使鏡筒上升或下降，再轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭對(duì)準(zhǔn)鏡臺(tái)孔，當(dāng)聽到輕微的碰響聲時(shí)，說(shuō)明目鏡和物鏡已成直線。 (2)對(duì)光：打開光圈，旋轉(zhuǎn)聚光器的升降螺旋，使聚光器升到與鏡臺(tái)平齊，用左眼觀察目鏡，同時(shí)用反光鏡的凹面對(duì)向光源，直到視野內(nèi)光線明亮均勻?yàn)橹埂?/P> (3)玻片標(biāo)本的放置：將玻片標(biāo)本有蓋玻片的一面向上置于載物臺(tái)上，玻片兩端用推進(jìn) 器或彈簧夾夾住，然后移動(dòng)玻片，使標(biāo)本對(duì)準(zhǔn)鏡臺(tái)孔。 (4)調(diào)節(jié)焦距：從側(cè)面注視低倍鏡的位置，使鏡筒緩慢下降，距標(biāo)本0.5cm左右，用左眼觀察目鏡，使鏡筒上升，直至視野出現(xiàn)清晰物象為止。如物象不在視野內(nèi)，可稍移動(dòng)玻片標(biāo)本的位置(注意：玻片移動(dòng)方向與物象移動(dòng)方向正好相反)。 2．高倍鏡的使用：按上述同樣的操作程序，先在低倍鏡下找到物象，將要放大的部分移至視野中央，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，調(diào)換高倍鏡頭，從側(cè)面注視物鏡，使高倍鏡頭對(duì)準(zhǔn)通光孔，轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器，直到物象清晰為止。 如按上述操作程序找不到物象時(shí)可考慮以下原因并予以糾正： (1)觀察標(biāo)本不在視野內(nèi)，可調(diào)換低倍鏡重新將標(biāo)本移到視野中心。 (2)標(biāo)本是否放反，應(yīng)有蓋玻片的一面向上方可找到物象。 (3)標(biāo)本退色，應(yīng)調(diào)節(jié)聚光器或光圈，以減少光的亮度。 在更換玻片標(biāo)本時(shí)應(yīng)先轉(zhuǎn)開高倍鏡取出玻片標(biāo)本，然后再放置其它的標(biāo)本。 3．油鏡的使用(油鏡的使用練習(xí)在實(shí)驗(yàn)四進(jìn)行)：先在低倍鏡下找到清晰物象后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，并使觀察的物象位于視野中央，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤，使高倍鏡移向一側(cè)，在玻片標(biāo)本觀察的部位上滴一滴香柏油，眼睛注視側(cè)面，使油鏡頭與香柏油接觸，左眼觀察時(shí)微微調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)器，直到視野中的物象清晰為止。 油鏡使用完畢，首先上升鏡筒，把油鏡頭移開，與高倍鏡平齊呈“八”字形，用擦鏡紙沾二甲苯少許把油鏡頭上的香柏油擦拭干凈，用綢布包好，送回鏡箱。 4．使用顯微鏡注意事項(xiàng)： (1)取送顯微鏡時(shí)，不可單手斜提，前后擺動(dòng)，以防部件滑脫著地?fù)p壞。 (2)下降鏡筒不宜用力過(guò)猛，速度過(guò)快，以免壓碎玻片標(biāo)本，碰碎鏡頭。 (3)使用油鏡頭或觀察液體標(biāo)本時(shí)，顯微鏡不宜傾斜，以防液體及標(biāo)本流出。 (4)不可隨意取出目鏡，以免灰塵落人鏡筒，更不能拆卸任何部位的零件。 三、顯微鏡的使用練習(xí)及細(xì)胞形態(tài)觀察： 1．纖維片：取一張纖維交叉片，先用低倍鏡觀察，將玻片標(biāo)本前、后、左、右慢慢移動(dòng)找到交叉點(diǎn)，然后移至視野中央，轉(zhuǎn)高倍鏡觀察，判斷紅綠纖維的上下位置。 2．蛙血涂片：取制作好的蛙血涂片，置低倍鏡下觀察，選擇色澤清楚，細(xì)胞不重疊部分換高倍鏡觀察，可見(jiàn)蛙紅細(xì)胞呈橢圓形，中央有一染成蘭色的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)為粉紅色。視野內(nèi)有時(shí)可見(jiàn)到圓形的白細(xì)胞，其核的形狀不規(guī)則(照片1)。 3．神經(jīng)節(jié)細(xì)胞：貓脊神經(jīng)節(jié)是脊髓兩側(cè)脊神經(jīng)背根上的一個(gè)膨大結(jié)構(gòu)，內(nèi)含許多神經(jīng)元 的胞體和平行排列的神經(jīng)纖維束(照片2)。 取貓脊神經(jīng)節(jié)橫切片，置低倍鏡下觀察，可見(jiàn)視野內(nèi)有許多大小不等的卵圓形細(xì)胞。轉(zhuǎn) 換高倍鏡下觀察，每個(gè)細(xì)胞的外圍有一層結(jié)締組織的被束，被束內(nèi)為細(xì)胞膜，但細(xì)胞膜界限 不明顯。中間大而圓的是細(xì)胞核，可見(jiàn)1—3個(gè)核仁。細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間的均質(zhì)部分為細(xì) 胞質(zhì)，被束與胞體之間可見(jiàn)到一些衛(wèi)星細(xì)胞，核小呈圓形。 4。小腸上皮細(xì)胞：取小腸上皮橫切片，置低倍鏡下觀察，可見(jiàn)小腸腔周圍有許多指狀的 突起，即為絨毛。選擇一根典型的絨毛移至視野中央轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，小腸上皮為單層柱狀 上皮，由大量的柱狀細(xì)胞和一些杯狀細(xì)胞組成。柱狀細(xì)胞呈長(zhǎng)柱狀，核呈橢圓形染色較深。 杯狀細(xì)胞鑲嵌在柱狀上皮細(xì)胞之間，形如高腳酒杯，杯口向著游離面，細(xì)胞核位于基底部附 近。細(xì)胞質(zhì)中有一個(gè)卵圓形的空腔，其中充滿粘液從杯口分泌到細(xì)胞表面，對(duì)小腸上皮起保護(hù)作用(照片3)。 作業(yè)與思考題 一、作業(yè)： 1．填寫普通光學(xué)顯微鏡各部件的結(jié)構(gòu)名稱。 二、思考題： 1．怎樣區(qū)別低倍鏡、高倍鏡和油鏡? 2．為什么在使用高倍鏡、油鏡時(shí)仍要從低倍鏡開始? 3．當(dāng)視野出現(xiàn)窗柜或窗外景物時(shí)怎么辦? 4．經(jīng)過(guò)哪些步聚才能在低倍鏡下找到物象? 實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞器及顯微測(cè)量 目的要求 1．掌握光學(xué)顯微鏡下高爾基體、線粒體、中心體形態(tài)結(jié)構(gòu)及分布。 2．學(xué)會(huì)目鏡測(cè)微器的使用。 材料用具 1．學(xué)生領(lǐng)用：顯微鏡、貓脊神經(jīng)節(jié)切片、蛙腎臟橫切片、蛙血涂片、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺。 2．實(shí)驗(yàn)室公用：中性紅染液、詹納斯綠B染液、牙簽、鑷子、吸水紙、載玻片、蓋玻片。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一、錄像：細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 二、細(xì)胞器的觀察： (一)高爾基體的觀察 取貓脊神經(jīng)節(jié)切片，在低倍鏡下觀察，可見(jiàn)到許多大小不等、被染成黃色的圓形神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。選擇神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較多的部位，轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察。在高倍鏡下，可見(jiàn)到細(xì)胞中央有一圓形、空泡狀細(xì)胞核，有的核內(nèi)可見(jiàn)有1—2個(gè)發(fā)亮的呈淡黃色的核仁。在細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)中，散布著被染成棕褐色、呈細(xì)長(zhǎng)彎曲的線狀、柱狀和網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)即是高爾基體(照片4)。 (二)線粒體的觀察 1．人口腔上皮細(xì)胞線粒體的活體染色及觀察。 (1)原理：線粒體是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)所需要的能量，主要是通過(guò)線粒體的呼吸作用來(lái)提供的。詹納斯綠B，(Janus Green B)是線粒體的專一性活體染色劑。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)而呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無(wú)色狀態(tài)。中性紅則將細(xì)胞核染成淡紅色。 (2)方法：將清潔的載玻片平放在桌上，然后在載玻片的中央滴1滴中性紅染液、1滴詹納斯綠B染液，漱口后，用牙簽粗端刮取口腔粘膜上皮細(xì)胞，在載玻片上的染液中輕輕攪勻，染色4—5分鐘(注意：染色過(guò)程中，染液不能干，快干時(shí)，可再加兩種染液各1滴)。 (3)觀察：蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余染液。高倍鏡下，可見(jiàn)在口腔上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，散在分布一些染成亮綠色的粒狀或短棒狀顆粒，即為線粒體。 2．蛙腎臟切片線粒體的觀察 取蛙腎切片，依次在低、高倍鏡下進(jìn)行觀察。注意觀察視野中許多圓形或橢圓形的腎小管，在腎小管細(xì)胞核的周圍有許多大小不等的藍(lán)色顆粒，即線粒體。各細(xì)胞中的線粒體，其形態(tài)、大小及數(shù)目不盡相同(照片5)。 (三)中心體的觀察 觀察馬蛔蟲子宮橫切片。在低倍鏡下，可以看到官腔內(nèi)有計(jì)多處于不同分裂時(shí)期的受精卵，外圍有一層厚的受精膜(注意不要誤以為是受精卵的細(xì)胞膜)，膜內(nèi)為大的圍卵腔。尋找其受精卵處于有絲分裂中期的細(xì)胞，然后換高倍鏡觀察。可見(jiàn)細(xì)胞兩極各有一個(gè)被染成深藍(lán)色的圓形粒狀小體(由于切片的關(guān)系，有的細(xì)胞只能在一極看到被染成藍(lán)色的小體或兩 極都看不到)，這就是中心體(內(nèi)有一對(duì)中心粒及其周圍的致密物質(zhì)——中心球)。在中心體的周圍，隱約可見(jiàn)纖細(xì)放射狀的星射線。星射線一部分參與形成細(xì)胞中的彷錘體(照片6)。 三、顯微測(cè)量： 在顯微鏡下測(cè)定標(biāo)本的大小，常用顯微測(cè)微尺加以測(cè)量，顯微測(cè)微尺一般由目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺組成。如圖2—1、2—2所示。 目鏡測(cè)微是一塊放人目鏡的標(biāo)尺，上面刻有50等份的刻度，而每一刻度(小格)的長(zhǎng)度是隨物鏡放大倍數(shù)而改變。所以使用前應(yīng)在所采用的放大部數(shù)的物鏡下用鏡臺(tái)測(cè)微尺加以標(biāo)定后，才能代表其實(shí)際長(zhǎng)度。因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺刻度的每格長(zhǎng)度是已知的，其標(biāo)定及測(cè)量方法如下： 1．將gydjdsj.org.cn/yishi/鏡臺(tái)測(cè)微尺置于鏡臺(tái)中央，先在低倍鏡下找到鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度，每一大格為0.1mm；每一小格為0.01mm(即10um)。 2．將鏡臺(tái)測(cè)微尺裝入目鏡筒中，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡筒或移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩標(biāo)尺刻度平行。 3.轉(zhuǎn)換高倍鏡，在視野中使物鏡測(cè)微尺任一刻度線與目鏡測(cè)微尺的任一刻度重合為起點(diǎn)，沿兩標(biāo)尺平行方向再找到另一重合刻度線為終點(diǎn)，記錄下兩重合線這一區(qū)段標(biāo)尺各自的格數(shù)，即可算出目鏡測(cè)微尺每小格的長(zhǎng)度。如低倍鏡下所標(biāo)定的目鏡測(cè)微尺的全長(zhǎng)為50格，相當(dāng)于鏡臺(tái)測(cè)微尺的68格，便可求出目鏡測(cè)微尺每小格等于13.6um。其換算公式為： 50:68=1:X X=1.36(格) 1.36*10(um)=13.6(um) 4．取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上需要測(cè)量的標(biāo)本，用目鏡測(cè)微尺的刻度來(lái)測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)度(格數(shù))所得的細(xì)胞長(zhǎng)度(格數(shù))乘以每刻度的微米數(shù)(um)，即為細(xì)胞的實(shí)際長(zhǎng)度。 作業(yè)與思考題 一、作業(yè) l、記錄4個(gè)蛙血紅細(xì)胞的長(zhǎng)短徑，并算出其平均值。 二、思考題 1、線粒體活體染色的原理是什么? 2、進(jìn)行細(xì)胞測(cè)量時(shí)，在低倍鏡下標(biāo)定目鏡測(cè)微尺的長(zhǎng)度，轉(zhuǎn)換高倍鏡后是否需要重新標(biāo)定。為什么? [附錄](méi) 詹納斯綠B染液的配制 將3滴詹納斯綠B飽和水溶液(溶解度為5．18％)，加到5m1無(wú)水乙醇中，再加1m1中性紅水溶液(中性紅10mg溶于150ml蒸餾水中)，并用黑紙包好于4C貯藏。 中性紅染液的配制 在5m1無(wú)水乙醇中，加20—30滴中性紅飽和水溶液(中性紅溶解度為5.64％)，即為中性紅染液。 實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞的化學(xué)成分 目 的 要 求 1、掌握生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的存在部位。 2、學(xué)習(xí)細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的檢測(cè)方法。 材 料 用 具 1、材料：馬鈴薯、動(dòng)物肝糖原切片、洋蔥鱗莖、蟾蜍、小鼠。 2、器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、酒精燈、火柴、刀片、小燒杯、剪刀、鑷子、吸管；吸水紙。 3、試劑：革蘭氏碘液、乙醚、95％乙醇、甲基綠-派洛寧染液、2％過(guò)氧化氫、5％三氯醋酸液、聯(lián)苯胺混合液、1％番紅溶液、0.1％酸性固綠、0.1％堿性固綠、5％硫酸酮。 實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容 一、糖類的觀察 糖類是有機(jī)體生命活動(dòng)能量的主要來(lái)源。 1、淀粉(starch)：淀粉有直鏈和支鏈之分，遇碘液顯藍(lán)色反應(yīng)，加熱時(shí)藍(lán)色消失，冷卻時(shí)又重新出現(xiàn)。藍(lán)色的產(chǎn)生是由于直鏈淀粉遇碘形成不穩(wěn)定的化合物——碘化淀粉之故。 取一片馬鈴薯徒手切片放在載玻片上，加一滴革蘭氏碘液，可見(jiàn)標(biāo)本立即染成藍(lán)色。蓋上蓋玻片，置于低倍鏡下觀察，可見(jiàn)在多角形的薄壁細(xì)胞中，有許多橢圓形藍(lán)色的顆粒，即淀粉粒。 2、糖原(glycogen)：又稱動(dòng)物淀粉，是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)貯藏能量的多糖類物質(zhì)。在肝臟中尤為豐富�？捎眠^(guò)碘酸雪夫試劑反應(yīng)(Periodic Acid Schiff reaction，簡(jiǎn)稱PAS反應(yīng))進(jìn)行檢測(cè)。PAS反應(yīng)是利用過(guò)碘酸將糖原氧化，把葡萄糖分子中2，3碳原子之間連接的鍵打開，將其上的乙二醇基變?yōu)槎┗�，醛基與雪夫試劑反應(yīng)形成紫紅色產(chǎn)物。 在光鏡下觀察肝糖原切片，可見(jiàn)肝細(xì)胞略呈多角形，中央有1～2個(gè)染成藍(lán)色圓形細(xì)胞核。在細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)許多紫紅色的小顆粒，即為肝糖原。 二、細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的顯示 1、原理：利用DNA和RNA聚合程度的不同，對(duì)堿性染料有不同的親和力而進(jìn)行選擇性染色。由于甲基綠分子上有兩個(gè)相對(duì)的正電荷，它對(duì)聚合程度高的DNA有強(qiáng)的親和力，DNA被染成藍(lán)色或綠色：而派洛寧分子上只有一個(gè)相對(duì)的正電荷，它僅和聚合程度低的RNA相結(jié)合，使RNA染成紅色。 2、方法 (1)洋蔥表皮細(xì)胞DNA、RNA的顯示 ①撕取洋蔥表皮一小片，置于載玻片上。 ②滴一滴甲基綠-派洛寧染液，藥品數(shù)據(jù)染色30～40分鐘。 ③用吸管吸一滴蒸餾水沖洗，立即用吸水紙吸干(因派洛寧易脫色)。 ④蓋上蓋玻片，鏡檢可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)和核仁呈淡紅色或紅色，表示RNA，而核質(zhì)呈藍(lán)色表示含有DNA。 (2)蟾蜍血涂片DNA、RNA的顯示 ①涂片：將蟾蜍用乙醚麻醉后，打開胸腔，剪開心臟。取心臟血做血涂片，室溫晾干。 ②固定：將晾干的涂片浸入95％乙醇中固定5分鐘，室溫晾干。 ③染色和分化：在標(biāo)本上滴數(shù)滴甲基綠-派洛寧染色液，染色5～l0分鐘，用蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去玻片上多余水分(不要吸得過(guò)干)。 ④觀察：光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核呈綠色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色。 三、細(xì)胞內(nèi)酸性蛋白和堿性蛋白的顯示 1．原理：由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同，在不同的pH溶液中，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶的凈電荷多少不同。如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理抽提掉核酸后，用帶負(fù)電荷的固綠堿性染液(pH8.2～8.5)染色，使在此pH環(huán)境中帶正電荷的堿性蛋白質(zhì)顯示出來(lái)。 2．方法 (1)取材和涂片：以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放入蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，室溫晾干。 (2)固定：將晾干的血涂片做好標(biāo)記，于95％乙醇中浸泡5分鐘，室溫晾干。 (3)三氯醋酸處理：將已固定的血涂片浸在60℃的三氯醋酸溶液中處理30分鐘，清水沖洗(一定要反復(fù)沖凈玻片上殘留的三氯醋酸，這是染色成功的關(guān)鍵)。 (4)染色：取兩張三氯醋酸處理過(guò)的血涂片分別放入0.1％酸性固綠和0.l％堿性固綠中，分別染色5分鐘和15分鐘，水沖、晾干、鏡檢。 3．結(jié)果：顯微鏡下可見(jiàn)經(jīng)酸性固綠染色的片子因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白分布被染成綠色，細(xì)胞核未著色；經(jīng)堿性固綠染色的片子，只有細(xì)胞核被染成綠色，這是堿性蛋白分布的部位。 四、細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶的顯示 1．原理：在生物體內(nèi)，細(xì)胞代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有害的過(guò)氧化氫。存在于動(dòng)植物組織中的過(guò)氧化氫酶，能使過(guò)氧化氫分解，生成水放出氧氣，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。過(guò)氧化氫酶系還能把許多胺類氧化為有色化合物。若用聯(lián)苯胺混合液處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的 過(guò)氧化氫酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色或棕色產(chǎn)物(藍(lán)色為中間產(chǎn)物——聯(lián)苯胺藍(lán)不穩(wěn)定，可自然轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣穆?lián)苯胺腙)，(照片27) 2．方法 (1)馬鈴薯過(guò)氧化氫酶顯示；徒手切片，取一薄片置于載玻片上，滴加新配制的2％過(guò)氧化氫溶液，可見(jiàn)組織周圍立即放出大量氣泡，提示植物活組織中有過(guò)氧化氫酶存在。若將上述組織放入開水后，再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，觀察其結(jié)果與上面是否一致。 (2)小鼠骨髓細(xì)胞過(guò)氧化氫酶的顯示 ①取小鼠1只，以頸椎錯(cuò)位法將其處死，迅速剖開其后肢暴露出股骨，將股骨的一端剪斷，用注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上，推片，室溫晾干。 ②將涂片放入0.5％硫酸銅中浸30秒～1分鐘。 ③取出涂片，直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng)3～6分鐘，清水沖洗。 ④放入1％番紅水溶液中染1～2分鐘，清水沖洗，室溫晾干，鏡檢。 ⑤觀察；涂片中可見(jiàn)一些細(xì)胞中有藍(lán)色顆粒，為過(guò)氧化氫酶所在位置。 (3) 蛙血細(xì)胞過(guò)氧化氫酶的顯示 ①如以上實(shí)驗(yàn)制作蛙血涂片，自然晾干。 ②在片中先滴二兩滴聯(lián)苯胺混合染料，用牙簽側(cè)面將其攤平，再在染料邊緣迅速滴兩滴H2O2酶，用牙簽輕輕攤平、混勻，靜置3-5分鐘，清水沖洗，晾干，鏡檢。 ③觀察；涂片中可見(jiàn)一些細(xì)胞中有藍(lán)色顆粒，為過(guò)氧化氫酶所在位置。 作業(yè)與思考題 一、作業(yè)：繪制細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶、堿性蛋白和酸性蛋白、DNA和RNA的分布圖。 二、思考題：過(guò)氧化氫酶、DNA和RNA顯示方法的實(shí)驗(yàn)原理各是什么? 【附錄】 生物繪圖的要求及方法 1、繪圖基本工具：鉛筆(HB、3H)、尺、橡皮、繪圖紙等。 2、生物繪圖必須真實(shí)，繪圖前應(yīng)選擇優(yōu)良的、有代表性的標(biāo)本，按照實(shí)物的形狀、各部分比例、位置及毗鄰關(guān)系進(jìn)行描繪。 3、繪圖需按一定比例，布局整齊美觀，大小適中。圖的下方注明該圖名稱。 4、圖的注釋應(yīng)從各部分結(jié)構(gòu)作出水平引線，結(jié)構(gòu)名稱寫于引線末端，書寫要整齊。 5、繪圖時(shí)先用軟鉛筆輕輕繪出輪廓，修改后再用硬筆以粗細(xì)均勻的線條繪出全圖。圖的明暗和立體感可用細(xì)圓點(diǎn)的疏密來(lái)表示，必要時(shí)可用彩色描出標(biāo)本的顏色。 實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞融合 目 的 要 求 了解聚乙醇(PEG)誘導(dǎo)的細(xì)胞融合的基本原理，掌握以PEG進(jìn)行細(xì)胞融合的操作方法。 材 料 用 具 1．材料；HeLa細(xì)胞或雞紅細(xì)胞。 2．器材；顯微鏡、普通離心機(jī)、離心管、水浴箱、吸管、載玻片、蓋玻片等。 3．試劑：50％聚乙二醇(MW＝l000)，pH6.0；Hanks液，pH7.4；RPMl1640培養(yǎng)基；0.25％胰蛋白酶；磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.2％亞甲基藍(lán)液等。 實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容 一、原理 細(xì)胞融合是20世紀(jì)60年代細(xì)胞學(xué)出現(xiàn)的一種新技術(shù)，現(xiàn)在已證明不僅是動(dòng)物和植物的種內(nèi)、種間或?qū)匍g的體細(xì)胞，甚至動(dòng)物和植物細(xì)胞之間也可相互融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)對(duì)于研究不同細(xì)胞之間的相互作用，雜種細(xì)胞遺傳特性的變異，人類及動(dòng)、植物的基因圖譜，以及為設(shè)計(jì)遺傳工程中的基因選擇，培育動(dòng)植物新品種等方面都是相當(dāng)有用的。目前其應(yīng)用范圍已廣及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)的許多分支學(xué)科。 細(xì)胞融合，就是兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成為一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。在自然情況下，受精過(guò)程即屬這種情況。此外，如腫瘤細(xì)胞具有的多核細(xì)胞，發(fā)炎及壞死部位見(jiàn)到的多核細(xì)胞等，都已有大量文獻(xiàn)資料證明是由單核細(xì)胞融合而成。現(xiàn)在所稱的細(xì)胞融合一般是指用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上體細(xì)胞合并在一起，它與兩個(gè)性細(xì)胞的結(jié)合(受精)不同，性細(xì)胞是單倍體，結(jié)合形成一種二倍體細(xì)胞；而體細(xì)胞融合可形成四倍體或多倍體細(xì)胞，由此形成的雜交細(xì)胞，其特性會(huì)有很大變化。 一般兩個(gè)細(xì)胞接觸并不發(fā)生融合現(xiàn)象，因?yàn)楦髯源嬖谕暾募?xì)胞膜，但在特殊融合因子的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜發(fā)生一定的變化，就可使兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞發(fā)生融合，形成新的雜種細(xì)胞。在細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中，采用的融合因子一般可分為三類：病毒，化學(xué)品和生物提取物，近年來(lái)，發(fā)展了一種用高壓脈沖引起細(xì)胞融合的新穎技術(shù)，但常用的融合因子仍為仙臺(tái)病毒(HVJ)和聚乙二醇，以下介紹PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理。 化學(xué)融合因子能引起細(xì)胞表面膜中磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)在結(jié)構(gòu)上發(fā)生重排。也有人認(rèn)為是膜內(nèi)脂肪的羥鍵活動(dòng)增加，或者是誘發(fā)膜內(nèi)顆粒積聚，在空氣和水的介面上使磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺單層的表面電位顯著降低�；瘜W(xué)藥品作為促融劑的優(yōu)點(diǎn)是易得、用法簡(jiǎn)單，還可深入探討細(xì)胞融合的分子機(jī)制。PEG濃度在40％～60％，分子量為1000左右均能使細(xì)胞融合：目前有取代病毒類促融因子的趨向。 作業(yè)與思考題 一、作業(yè)：簡(jiǎn)述細(xì)胞融合的基本原理和操作方法。 二、思考題： 1、何為細(xì)胞融合，細(xì)胞融合的意義何在? 2、通常融合因子有哪幾類，影響PEG因素是什么? 【附錄】 試劑配制 1、Hanks液 原液甲： NaCI 160g KCl 8g MgS04·7H2O 2g MgCl2·6H2O 2g 溶于800ml蒸餾水，混勻后加入CaCl2(無(wú)水)2.8g，加蒸餾水至1000ml。濾紙過(guò)濾，加入氯仿2ml，4℃保存。 原液乙： Na2HPO4·12H20 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20.0g 溶于800ml蒸餾水中，濾紙過(guò)濾，加入0.5％酚紅80ml，再加蒸餾水至1000ml，最后加入防腐劑氯仿2ml，置4℃?zhèn)溆谩?/P> 工作液： 甲乙兩液各1份，重蒸餾水18份，混勻分裝包扎好瓶口，經(jīng)6.81kg(15磅)高壓滅菌20～30分鐘，然后置4℃保存?zhèn)溆�，可�?個(gè)月，使用前以5％NaHCO3調(diào)節(jié)pH7.4。 2、1％酚紅液 將1.0g酚紅置于研缽中，綬慢滴入0.1mo1／L的NaOH(0.4％)15ml，邊加邊磨，直至全部溶解，然后加入85ml重蒸餾水，顏色為深紅，經(jīng)粗濾紙過(guò)濾后使用，室溫保存。 3、50％PEG溶液(需現(xiàn)配現(xiàn)用) 稱取5gPEG(MW=1000)置試管中，在酒精燈上溶化，然后與預(yù)熱37℃的Hanks液混勻，即成50％PEG溶液，當(dāng)pH6.0時(shí)融合效率最高。 實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞分裂 目的要求 1.掌握細(xì)胞有絲分裂各期特點(diǎn)。 2.熟悉誠(chéng)數(shù)分裂各期染色體變化的特點(diǎn)。 材料用具 學(xué)生領(lǐng)用：顯微鏡、馬蛔蟲子宮橫切片、紫露草花粉母細(xì)胞壓片。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一、錄像：蝗蟲精母細(xì)胞減數(shù)分裂。 二、動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂的觀察。 取馬蛔蟲子宮橫切片，置于低倍鏡下觀察，可見(jiàn)到馬蛔蟲子宮腔內(nèi)有許多近圓形的、處于不同分裂時(shí)期的受精卵細(xì)胞。在低倍鏡下找出前期、中期、后期、末期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)換成高倍鏡仔細(xì)觀察。細(xì)胞有絲分裂各期的特點(diǎn)如下： 1、前期：細(xì)胞核膨大，染色質(zhì)逐漸螺旋化為絲狀的染色絲，其后進(jìn)一步縮短變粗，形成一定形態(tài)和數(shù)目的染色體(這時(shí)的每條染色體由兩條染色單體組成，但在光鏡下，一般不易看清)，中心粒一分為二，每對(duì)中心粒放出星射線，形成星體，兩個(gè)早體移向細(xì)胞兩極，核仁、核膜逐漸消失(照片8)。 2、中期：每條染色體的兩條染色單體逐漸分開(但著絲粒仍未分離)。全部染體(2n=6)移向細(xì)胞中央的赤道面上，形成赤道板。在赤道板的兩面有許多紡錘絲連接細(xì)胞兩極和染色體動(dòng)粒，但不易觀察到，此時(shí)染色體形態(tài)最典型。極面觀的中期細(xì)胞染色體排在赤道面上，呈花瓣?duì)?照片6)。 3、后期：著絲�？v裂為二。這時(shí)，每條染色體的兩條染色單體己完全分開，由于紡錘絲的牽引，分別向細(xì)胞兩極移動(dòng)，形成了數(shù)目相等的兩約染色體(照片7)。 4、末期：染色體移至細(xì)胞兩極并解旋為染色質(zhì)，星體消失，核仁、核膜重新出現(xiàn)，細(xì)胞中部的細(xì)胞膜內(nèi)凹、最后橫縊，使細(xì)胞分裂為—二，形成兩個(gè)子細(xì)胞(照片8)。 三、植物細(xì)胞減數(shù)分裂的觀察 取紫露草花粉母細(xì)胞壓片，在低倍鏡下尋找減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞，轉(zhuǎn)換高倍鏡，對(duì)照附后照片9～2l，觀察第—次減數(shù)分裂和第二次減數(shù)分裂各期以及前期I各個(gè)分期的細(xì)胞： (一)第一次減數(shù)分裂 每個(gè)初級(jí)花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)第——次減數(shù)分裂形成兩個(gè)次級(jí)花粉母細(xì)胞。減數(shù)分裂過(guò)程與有絲分裂相似，也可分為前、中、后、末期，不同的是前期1染色體發(fā)生了系列的特殊變化： 即同源染色體的聯(lián)會(huì)和交換。 1、前期I：即第一次減數(shù)分裂前期。在減數(shù)分裂中，以前期I最有特征性，核的變化復(fù)雜，依染色體變化，又可分為—下列各期： (1)細(xì)線期：減數(shù)分裂開始。本期細(xì)胞是一些細(xì)胞核較大而染色較淺的細(xì)胞群核內(nèi)出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的染色絲，繞成一團(tuán)。在細(xì)絲的局部可見(jiàn)到念球狀的染色粒，核仁明顯(照片9)。 (2)偶線期：本期細(xì)胞核更大，同源染色體配對(duì)(聯(lián)會(huì))。起初每對(duì)同源染色體在核的同一側(cè)開始配對(duì)，另一側(cè)仍散開未配對(duì)，這種圖象似花朵。配對(duì)的結(jié)果，染色體由n對(duì)變成n個(gè)二價(jià)體。這時(shí)染色體細(xì)長(zhǎng)，看不清其數(shù)目(照片10)。 (3)粗線期：染色體縮短變粗。每個(gè)二價(jià)體含有4條染色單體，叫四分體。每條染色體的兩條染色單體互稱為姐妹染色單體。同源染色體的染色單體間互稱為非姐妹染色單體。非姐妹染色單體間的交換是在這時(shí)期完成，但在形態(tài)上難以見(jiàn)到(照片11)。 (4)雙線期：本期染色體縮得更短更粗，同源染色體開始分離，但沒(méi)有完全分開。由于非姐妹染色單體發(fā)生局部交換，可看到交叉現(xiàn)象，且交叉逐漸端化(向端部移動(dòng))(照片12)。 (5)終變期：染色體極粗短， 并向核的四周移動(dòng)。交叉端化明顯，形成“O”、“V”、“8”等構(gòu)象。此時(shí)染色體最清楚，便于計(jì)數(shù)。核膜、核仁消失(照片13)。 2、中期I：二價(jià)體向細(xì)胞中部集中，排列于赤道面上。從赤道面觀可見(jiàn)到四分體排成一列(2n=12)；從極面觀可見(jiàn)到四分體排在一個(gè)平面上(照片14)。 3、后期I：細(xì)胞變長(zhǎng)，同源染色體受兩極紡錘絲的作用，各自分離，即1個(gè)四分體分裂成2個(gè)二分體。二分體隨機(jī)地分為兩組，各移向細(xì)胞兩極，染色體數(shù)目減半(照片15)。 3、末期I：到達(dá)兩極的染色體解旋、延長(zhǎng)核膜重建，央出現(xiàn)細(xì)胞板，形成兩個(gè)次級(jí)花粉母細(xì)胞(照片16)。 (二)第二次減數(shù)分裂 次級(jí)花粉母細(xì)胞形成后，經(jīng)過(guò)短暫的間期，染色體不復(fù)制，就進(jìn)入第二次減數(shù)分裂。第二次減數(shù)分裂仍分為前、中、后、末四期。次級(jí)花粉母細(xì)胞較小，往往兩兩相靠近。 1、前期II：每個(gè)二分體螺旋、縮短，但著絲粒仍連在一起，核膜消失(這一時(shí)期短暫，不易看到，可不必觀察)(照片17)。 2、中期II：本期細(xì)胞胞質(zhì)均勻，染色體。二分體排列在赤道面上， 赤道面觀可見(jiàn)二分體排成—列在細(xì)胞中央，極面觀可見(jiàn)二分體象花朵似地排在細(xì)胞中央(照片18)。 3、后期II：每個(gè)二分體著絲粒分開，形成兩個(gè)單分體。每一單分體各具有一著絲粒，故可稱為染色體，分別移向細(xì)胞兩極(照片19)。 4、末期II：每個(gè)細(xì)胞拉長(zhǎng)， 中央形成細(xì)胞板。一個(gè)次級(jí)花粉母細(xì)胞形成兩個(gè)小孢子。即一個(gè)花粉母細(xì)胞經(jīng)兩次分裂形成四個(gè)小孢子——四分孢子(照20、21)。 作業(yè)與思考題 一、作業(yè)：繪制初級(jí)精母細(xì)胞(2n=4)減數(shù)分裂的中期I、后期I、中期II和后期II的模式圖。 二、思考題： 1、細(xì)胞有絲分裂各期的形態(tài)特征是什么? 2、減數(shù)分裂各期的主要特征是什么? 驗(yàn)六 兔腎細(xì)胞基因基因組DNA的制備 目的要求 了解從動(dòng)物細(xì)胞中提取高分子量基因組DNA的基本方法。 材料用具 1．學(xué)生領(lǐng)用：具塞離心管8只、微量加樣器1支、毛細(xì)吸管2支、培養(yǎng)皿1付、抽提液1瓶、試管架。 2．實(shí)驗(yàn)室公用：高速離心機(jī)、振蕩器、微量加樣器、冰酒精、NDP勻漿； 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一、錄像：細(xì)胞基因組DNA制備技術(shù)。 二、原理：DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的，因此提取出脫氧核糖核蛋白復(fù)合物(DNP)后，必須將其蛋白質(zhì)除去。動(dòng)物和植物組織的脫氧核糖核蛋白可溶于水或濃鹽溶液，而核糖蛋白則溶于低鹽溶液中，利用這一性質(zhì)將脫氧核糖核蛋白與核糖核蛋白以及其他雜質(zhì)分開分離得到脫氧核蛋白后，再進(jìn)一步將蛋白質(zhì)等雜質(zhì)除去。 去蛋白的方法很多，我們用含辛醇或異戊醇的氯仿震蕩核蛋白溶液，使乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)疑膠停留在水相及氯仿中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積95％冰乙醇將DNA沉淀析出。 三、方法與步驟 (一)材料處理：取兔腎除去血水和結(jié)締組織，稱重后切成小塊搗碎。加入2倍體積(V／'V)0．1M氯化納0.05M、PH7.0檸檬酸納緩沖液(簡(jiǎn)稱緩沖液)于組織搗碎機(jī)上打碎1分鐘。組織糜于3000轉(zhuǎn)／分離心15分鐘，將沉淀物用緩沖液洗滌2次，并用勻漿器研磨洗滌，每次如前離心。最后得到的沉淀物加6倍組織重的10％氯化鈉溶液，充分?jǐn)噭蛑帽渲羞^(guò)液(最好放置24～48小時(shí))。 (二)提取DNP：將冰箱中過(guò)夜的半透明粘稠狀液體，用滴管吸出，慢慢注入11倍體積的冰蒸餾水內(nèi)。這時(shí)有白色絲狀物——核蛋白析出，用玻璃棒攪起，待干后，將沉淀物再8倍組織重的10%氯化鈉溶液中，迅速攪拌以加速溶解。再研磨制成DNP勻漿，冰箱保存?zhèn)溆谩? (三)提取DNA(去蛋白)：取500ulDNP勻漿加入抽提液600ul，劇烈振蕩5分鐘左右，6000轉(zhuǎn)／分離心15分鐘，使其分層。上層為含有DNA和DNA核蛋白的水相，下面為抽提液的有機(jī)溶劑層，變性蛋白凝膠介于兩層之間(圖6—1)。吸出上層，再用抽提液如前進(jìn)行脫蛋白，直到界面處不再出現(xiàn)蛋白凝膠為止。最后吸出上清液并將其移入800ul冰乙醇中靜置5分鐘。以10000轉(zhuǎn)／分離心5分鐘，取沉淀物DNA去乙醇備用。 作業(yè)與思考題 一、作業(yè)：實(shí)驗(yàn)報(bào)告(包括操作步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體會(huì))。 二、思考題： 1．哪一步操作是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，應(yīng)該如何操作? 2．影響DNA純度高低主要因素是什么? [附錄](méi) 介紹兩種較常采用的去蛋白方法：①用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA。②苯酚法：用苯酚處理，然后離心分層，DNA或溶于上層水相中，或存在于中間殘留物中，蛋白質(zhì)變性后停留在酚層內(nèi)。由于苯酚能使蛋白質(zhì)迅速變性，因而抑制了核酸酶活性，并且操作過(guò)程比較緩和，可以得到較好的DNA標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)七 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 目的要求 了解DNA電泳的基本原理和方法。 材料用具 1，試劑：電泳液、瓊脂糖(上海東海制藥廠)、溴酚蘭——甘油溶液、溴乙淀、DNA樣品 2。器材：電泳槽、電泳儀、高壓鍋、微量加樣器、紫外分析儀。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 一、錄像：DNA的瓊脂糖凝膠電泳 二、原理：凝膠電泳是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的一項(xiàng)重要技術(shù)，也是DNA的限制性內(nèi)切酶切割片段分析、分離、純化的一種不可缺少的方法。經(jīng)瓊脂糖(agarose)凝膠為支持介質(zhì)的電泳已廣泛應(yīng)用于核酸研究中，瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)為DNA分子及其片段的分子量測(cè)定和DNA分子構(gòu)象的分析提供了重要手段。 DNA的電泳原理和蛋白質(zhì)的電泳原理基本相同。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的PH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA分子在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)而泳動(dòng)，除此電荷效應(yīng)外，凝膠介質(zhì)還有分子篩效應(yīng)，與分子大小和構(gòu)象有關(guān)。由于DNA分子或DNA片段的分子量存在差別，故電泳后呈現(xiàn)遷移位置的差異。 三、方法與步驟：1．瓊脂糖膠液的制備：稱取2克瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml電泳液，瓶口扣小燒杯，置于家庭用小型高壓鍋內(nèi)，加熱冒出大量蒸汽時(shí)扣閥，維持8—10分鐘，瓊脂糖即可全部融化于電泳液中，取出搖勻，即成為2％瓊脂糖膠液。 2．凝膠板制備：當(dāng)瓊脂糖膠液溫度降至55度左右時(shí)加溴化乙錠至終濃度為0.5ug/ml并搖勻，倒人凝膠架板，去除氣泡。在室溫下放置0.5—1小時(shí)，待膠液全部．凝結(jié)后，垂直撥出點(diǎn)樣梳，此時(shí)在膠的一端形成相互隔開的樣品槽(又稱加樣孔)。立即將瓊脂糖膠板放人注有電泳液的電泳槽中，以防止瓊脂凝膠中水分蒸發(fā)而造成裂縫。 3．加樣：將10ul的DNA溶液與預(yù)先點(diǎn)樣于膠皮上的2ul溴酚蘭——甘油溶液混勻，用微量加樣器將混合后的樣品小心地注入樣品槽內(nèi)(混合在樣品中的甘油可增加樣品液的比重，因此樣品可以自然平鋪于樣品槽中，不易擴(kuò)散。由于溴酚蘭染料的存在，可直接觀察到加樣的情況，而且染料在電泳過(guò)程中可作為指示標(biāo)志)。 4．電泳：連通電源線，打開電泳儀開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓100V，電泳時(shí)間約20-30分鐘。電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，戴上手套，取出凝膠置于紫外分析儀上，可見(jiàn)到橙紅色螢光條帶，放置時(shí)間超過(guò)4-6小時(shí)后，熒光減弱。因此，初步觀察結(jié)束后，應(yīng)立即照像。 作業(yè)與思考題 一、作業(yè)：簡(jiǎn)述DNA電泳的基本原理和操作方法。 二、思考題： 1．溴化乙錠與溴酚蘭在電泳過(guò)程中有什么作用? 2．本次實(shí)驗(yàn)操作成敗的關(guān)鍵步驟在哪里? [附錄](méi) L溴化乙錠染色原理及試劑配制：溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)，溴化乙錠分子可插 入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)堿基之間，它和核酸形成一種熒光絡(luò)合物，在254nm波長(zhǎng)紫外光 照射下，呈現(xiàn)橙黃色的熒光。稱取5毫克溴化乙錠，用無(wú)離子水溶解，定容到10毫升，取1毫升稀釋到1升，最終濃度為0.5微克／毫升。 2．溴酚蘭——甘油溶液(0.05％溴酚蘭--50％甘油溶液)：先配制0.1％溴酚蘭水溶液， 然后取1份0.1％溴酚蘭溶液與等體積的甘油混合即成。 | 
