3.經(jīng)典的電壓鉗（或電壓固定)實驗 從上述可知，Hodgkin等對于動作電位產(chǎn)生機制的說明，關(guān)鍵在于膜受刺激時對Na⁺、K⁺的通透性發(fā)生了有選擇而時間亦有先后的改變，但這只是根據(jù)所測得的膜內(nèi)外電位改變對照Nernst公式進行的推論，實驗并沒有對膜的通透性進行直接的測量和動態(tài)描述。為此，他們又應(yīng)有當時最先進的電子學(xué)技術(shù)，設(shè)計和進行了著名的電壓鉗（voltage clamp)實驗。實驗的設(shè)計根據(jù)是：離子作跨膜移動時形成了跨膜離子電流（I)，而通透性亦即離子通過膜的難易程度，就是膜的電阻（R)或其倒數(shù)電導(dǎo)（G)，因此所謂膜對某種離子通透性增大時，實際是膜對該離子的電導(dǎo)加大；對于帶電離子來說，膜電導(dǎo)就是膜通透性的同義語。根據(jù)歐姆定律，I=VG，可知在膜兩側(cè)電位差（V)固定不變的條件下，測出的跨膜電流I的變化，就可作為膜電導(dǎo)變化的度量。測定膜在受刺激時跨膜電流的改變在技術(shù)上是容易的，但在這過程中要保持膜電位固定不變卻不容易；因為當存在跨膜離子電流時，離子的進出膜會使不導(dǎo)電而有電容（C)特性的脂質(zhì)膜充電或放電，因而根據(jù)V=Q/C的關(guān)系（其中Q為電量，相當于I和時間t的乘積)，跨膜離子的移動必然要引起跨膜電位的改變；實際上記錄到的動作電位就是這種改變。正因為如此，Hodgkin等自行設(shè)計了一種應(yīng)用負反饋原理的電子學(xué)裝置，使它們能在跨膜電位維持恒定（恒定的數(shù)值可由實驗者通過實驗裝置預(yù)先設(shè)定)的情況下，測量跨膜離子電流的強度改變，并由此計算出膜電導(dǎo)即膜通透性的變化情況。電壓鉗實驗的基本原理模式圖如圖2-12所示。圖中電極1插入巨大神經(jīng)軸突內(nèi)一定距離，用來測量和監(jiān)察這一段軸突膜內(nèi)的電位，此電極先連到一個電壓放大器，再在一個示波器上顯示；電極1測得電位值經(jīng)放大后同時輸給一個負反饋放大器（FBA)，這是整個儀器設(shè)計的關(guān)鍵部分，它可把測得的膜內(nèi)電位同來自一個電壓源的、由實驗者預(yù)先設(shè)定的要求保持恒定的電位值進行比較，如果二者有差值，F(xiàn)BA就會通過電極2向軸突膜內(nèi)輸出相應(yīng)強度和方向的電流，由于儀器線路的精密設(shè)計和快速反應(yīng)，電極2輸出電流的改變正足以補償標本由于跨膜離子電流使膜充放電而引起的跨膜電位的變動，于是與電極1相邊的示波器上顯示出膜內(nèi)電位固定在設(shè)定的數(shù)值，而在電流放大器IA上測得的跨膜離子電流的變化，就反映了膜電導(dǎo)的變化。

圖 2-12 電壓鉗實驗布置模式圖

　　電壓固定實驗獲得了許多有意義的結(jié)論。首先一點是，只有設(shè)定的膜內(nèi)電位固定在去極化水平時，才有可能出現(xiàn)膜的Na⁺電導(dǎo)（G_Na)和K⁺電導(dǎo)（G_k)的增大，并且設(shè)定電位愈接近零值，電導(dǎo)的增大也愈明顯；相反，如果設(shè)定的膜內(nèi)電位值是超極化的，則不可能引起跨膜離子電流和膜電導(dǎo)的改變，這一點以后還要談到。以圖2-13的記錄曲線為例，分析不同離子的電導(dǎo)在一次興奮過程中的變化情況。圖中最上方曲線表示在一次電壓鉗實驗中，把膜內(nèi)電位由靜息時的－65mV突然固定（這就是（clamp)的意思)在－9mV，結(jié)果很快引起一次如曲線A的跨膜電流變化曲線，這曲線的開始部分是內(nèi)向的，以后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橥庀螂娏鳌Ｖ挥涗浀絻?nèi)向或外向電流還不能說明電荷的攜帶者是何種離子，根據(jù)過去的實驗者有理由認為，先出現(xiàn)的內(nèi)向電流可能是Na⁺電流（I_Na)，外向電流則可能是K⁺電流（I_k)。用附加的實驗觀察證明了這點：假定把標本浸浴液中的NaCI用相同摩爾數(shù)的氯化膽堿來代替，則在同樣的條件下只能記錄到較晚出現(xiàn)的曲線B，它是外向的，這顯然是因為不能出現(xiàn)內(nèi)向的I_Na的結(jié)果；把曲線A和B逐點相減，就能得到曲線C，它就是內(nèi)向的I_Na；由I_Na、I_k兩條曲線，就可算出G_Na和G_k的變化曲線，其特點是：（1)G_Na和G_k都是電壓依從性的，只能由跨膜電位的去極化所激活，但G_Na被激活得早，是動作電位上升支出現(xiàn)的基礎(chǔ)，而G_k激活出現(xiàn)緩慢，是動作電位復(fù)極到靜息電位水平的基礎(chǔ)；（2)G_Na有失活（inactivation)狀態(tài)而G_k沒有此特性，其證明是圖2-13中曲線C只存在1～2ms，以后跨膜電壓雖仍固定在－9mV的水平，但G_Na早已恢復(fù)到原初水平，而代表G_k的曲線B雖然出現(xiàn)較晚，但它在設(shè)定電位持續(xù)期間一直維持在較同的水平。G_Na失活的出現(xiàn)和G_k的激活是造成神經(jīng)纖維和骨骼肌細胞表現(xiàn)短促的鋒電位的原因；在膜復(fù)極以后G_Na的失活狀態(tài)才能消失，這時G_Na才能因膜的去極化而再出現(xiàn)增大。

圖2-13　電壓鉗實驗結(jié)果示意圖

將巨大神經(jīng)纖維的膜電位由原來的-65mv突然上升并固定于-9mv的水平時，

膜的離子電流的變化情況（曲線A、B、C的意義見正文)

　　根據(jù)圖2-13中I_Na和I_k兩條電流曲線，即可計算出同這兩者相對應(yīng)的G_Na和G_k曲線，再根據(jù)這一段膜所具有的電容的數(shù)值（有人測得每cm²的槍烏賊軸突膜的電容約為1μF)，就可算出如果“允許”每一瞬間的離子移動在電容上形成電位改變時，有可能造成怎樣的跨膜電位的改變，這正是不進行“電壓固定”時的情況，而由此作出的電位變化曲線正好同在一般實驗中記錄到的動作電位的波形特點一致，如圖2-14所示。這進一步說明了電壓鉗實驗證明動作電位產(chǎn)生機制的正確性。

　　4．膜片鉗實驗和單通道離子電流的記錄通過上節(jié)關(guān)于電壓門控通道的特性分析已知，所謂膜對某種離子通透性的改變，實際上決定于膜結(jié)構(gòu)中有關(guān)離子通道蛋白質(zhì)分子的功能狀態(tài)；例如，Hodgkin等測出的G_Na的變化，實際是那一段軸突膜上眾多的電壓門控式Na⁺通道因膜的去極化而開放的結(jié)果。在Hodgkin等當時進行的膜電導(dǎo)改變的數(shù)學(xué)模擬中，已經(jīng)明確提示，G_Na和G_k的改變不是均勻地發(fā)生在整個膜平面上，而是與膜上某些特定的“點”有關(guān)，不久又發(fā)現(xiàn)，有些藥物可以選擇性地阻斷某種離子的跨膜移動，如河豚毒可以單獨阻斷G_Na而不影響G_k，四乙基銨可以單獨阻斷G_k而不影響G_Na；以同位素標記的河豚毒只能與膜上某些特殊的“點”作特異性結(jié)合，而標記的四乙基銨只能與另一些“點”結(jié)合。這些實驗以及興奮過程中離子移動數(shù)目之多與快，逐漸使人們推斷膜結(jié)構(gòu)中有特殊的蛋白質(zhì)離子通道的存在。這說明，“通道”概念的提出，遠在通道的實質(zhì)被闡明以前，是前者促進了對后者的進一步探索。70年代中期由Neher和Sakmann等發(fā)展出一種能夠記錄膜結(jié)構(gòu)中單一的離子通道蛋白質(zhì)分子的開放和關(guān)閉、亦即測量單通道離子電流和電導(dǎo)的技術(shù)，稱為膜片鉗實驗。

圖 2-14 電導(dǎo)變化與電位變化的關(guān)系示意圖

根據(jù)電壓鉗實驗中測得的Na⁺電導(dǎo)（G_Na)和K⁺電導(dǎo)（G_k)的變化過程，

可以算出在膜電位不進行人為固定時，相應(yīng)的Na⁺、K⁺離子電流在膜電容

上引起的電位變化（實線)，其形狀正同在標本上記錄到的動作電位的波形一致

　　膜片鉗實驗的基本原理如圖2-15A所示：用一個尖端光潔、直徑約0.5～3μm的玻璃微電極同神經(jīng)或肌細胞的膜接觸而不刺入，然后在微電極另一端開口施加適當?shù)呢搲海瑢⑴c電極尖端接觸的那一小片膜輕度吸入電極尖端的纖細開口，這樣在這小片膜周邊與微電極開口處的玻璃邊沿之間，會形成緊密的封接，在理想的情況下其電阻可達數(shù)個或數(shù)十千兆歐（其物理過程目前尚不清楚)，這實際上把吸附在微電極尖端開口處的那一小片膜同其余部分的膜在電學(xué)上完全隔離開來；如果在這一小片膜中只包含了一個或少數(shù)幾個通道蛋白質(zhì)分子，那么通過此微電極就可能測量出單一通道開放時的離子電流和電導(dǎo)，并能對單通道的其他功能特性進行分析。

圖2-15 膜片鉗實驗布置示意圖

A：圖中I_p為記錄到的單通道電流，V_CMD決定設(shè)定的膜電位數(shù)值

B：在大鼠胚胎骨骼肌細胞膜片上記錄到的由ACH激活的單通道
離子電流，強度為pA（皮安)級

　　從Neher等最初用膜片鉗技術(shù)觀察骨骼肌終板膜處的單一ACh-門控通道機能特性開始，已經(jīng)對多種通道進行了觀察，發(fā)現(xiàn)它們一般有如下共同特性：（1)不論是化學(xué)門控或電壓門控通道，它們的開放和關(guān)閉都是突然的，使描繪出的電流曲線呈方波狀，說明相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子可以從一種構(gòu)象快速地躍變到另一種構(gòu)象；（2)每種通道開放時具有恒定的電導(dǎo)，即在恒定的情況下，只能看到“開”或“關(guān)”兩種狀態(tài)，很少看到“半開”或“部分開”的情況；（3)即使是同一通道分子，每次開放的持續(xù)時間長短也不一致，似乎說明蛋白質(zhì)分子可在開放和關(guān)閉兩種構(gòu)象之間“擺動”，停留在某種狀態(tài)的長短具有隨機的性質(zhì)；（4)在化學(xué)門控通道結(jié)合了相應(yīng)的化學(xué)信號分子，或電壓門控通道所在膜兩側(cè)處于特定的電位差的情況下，“擺動”的次數(shù)增多，開放的機率增大，而“失活”使開放的機率減小。醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站www.gydjdsj.org.cn

　　用單通道記錄可說明在自然情況下整段膜的離子電導(dǎo)和離子電流的形成機制；以上述G_Na增大為例，它顯然是該段膜中眾多的Na⁺通道在去極化的影響下出現(xiàn)開放的機率增加所決定的，而在每一瞬間同時出現(xiàn)的各通道的電導(dǎo)或離子電流相互疊加，于是如圖2-16B所示，這種疊加形成的Na⁺電流曲線，正好和圖2-13中的曲線C相似。

　　膜片鉗實驗可用于各種細胞，由于微電極不刺入細胞，即使用于纖小的細胞也不致造成損傷。膜片鉗實驗已有各種變式，如吸著在微電極尖端的小膜片可以隨電極而同原細胞脫離，把它們浸入人工浸浴液中，就可以觀察某些因素在膜的胞漿側(cè)怎樣影響通道功能；也可以形成膜的胞漿側(cè)面向微電極尖端開口而膜表面?zhèn)让嫦蚪∫旱膶嶒災(zāi)Ｊ�，等等。膜片鉗實驗也已用于細胞生物電以外的功能研究，如細胞的分泌過程等。

圖2-16 電壓門控Na⁺通道的膜片鉗記錄A：

隨著靜息電位（Em)由－110mV突然固定到－50mV，
在3次膜片鉗實驗記錄到的離子電流 B：將144次膜片鉗記錄
到的離子電流曲線進行平均疊加，得到一條類似圖
2-13中曲線C的Na⁺電流曲線，說明后者是多數(shù)Na⁺通道激活的結(jié)果

　　三、興奮的引起和興奮的傳導(dǎo)機制

　　（一)閾電位和鋒電位的引起

　　膜內(nèi)負電位必須去極化到某一臨界值時，才能在整段膜引發(fā)一次動作電位，這個臨界值大約比正常靜息電位的絕對值小10～20mV，稱為閾電位。例如，巨大神經(jīng)軸突的靜息電位為－70mV，它的閾電位約為－55mV。這不是由于小于閾電位的去極化不引起G_Na的增加，實際情況是這時也有一定數(shù)目的Na⁺通道開放，但由于膜對K⁺的通透性仍大于Na⁺，因而少量的Na⁺內(nèi)流及其對膜內(nèi)電位的影響隨即被K⁺的外流所抵消，因而去極化不能繼續(xù)發(fā)展下去，不能形成動作電位。只有當外來刺激引起的去極化達到閾電位水平時，由于較多量Na⁺通道的開放造成了膜內(nèi)電位較大的去極化，而此去極化已不再能被K⁺外流所抵消，因而能進一步加大膜中Na⁺通道開放的機率，結(jié)果又使更多Na⁺內(nèi)流增加而造成膜內(nèi)進一步的去極化，如此反復(fù)促進，就形成一種正反饋的過程，稱為再生性循環(huán)，其結(jié)果使膜內(nèi)去極化迅速發(fā)展，形成動作電位陡峭的升支，直至膜內(nèi)電位上升到近于Na⁺平衡電位的水平。由此可見，閾電位不是單一通道的屬性，而是在一段膜上能使Na⁺通道開放的數(shù)目足以引起上面描述的再生性循環(huán)出現(xiàn)的膜內(nèi)去極化的臨界水平。由此也不難理解，只要刺激大于能引起再生性循環(huán)的水平，膜內(nèi)去極化速度就不再決定于原刺激的大小；整個動作電位上升支的幅度也只決定于原來靜息電位的值和膜內(nèi)外的Na⁺濃度差，而與引起此次動作電位的刺激大小無關(guān)。此即動作電位所以能表現(xiàn)“全或無”現(xiàn)象的機制。

　　閾電位是用膜本身去極化的臨界值來描述動作電位的產(chǎn)生條件。所謂閾強度，是作用于標本時能使膜的靜息電位去極化到閾電位的外加刺激的強度；這就是閾強度和閾電位在概念上的區(qū)別。

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