一、特點 1、雜交頻率高 2、受接合型或致育性限制較少,但與親緣性有一定關系。 3、遺傳物質傳遞更完整。 4、存在兩株以上親株同時參與融合可能。 5、可以采用產量性狀較高菌株作融合親株。 6、提高生產性狀的潛力較大。醫(yī)學全在線友情提供med126.com 7、原生質體較容易進行轉化,可用于工業(yè)微生物育種工作 二、主要步驟 1、原生質體制備: 作為育種菌株須:①具有良好生產性狀②具有一些穩(wěn)定的明顯的遺傳標記。 一般采用雙標記,避免回復突變干擾。離心收集對數(shù)后期菌體,破壁。原生質體低滲中易破裂,使用滲透壓穩(wěn)定劑進行保護。(甘露醇、山梨醇、蔗糖、氯化鉀、氯化鈉等) 離心收集原生質體。 2、原生質體融合: 加入促融合劑—聚乙二醇(PEG)及Ca2+、Mg2+,使原生質體表面形成電極性,相互易于吸引,形成聚集物。UV、電場、激光等技術可應用。 3、再生成正常細胞: 融合后的原生質體不具細胞壁,不能在普通培養(yǎng)基上增殖,無法表現(xiàn),必須使其重新形成壁。再生培養(yǎng)基必須具有與原生質體體內相同滲透壓,常用含Ca2+、Mg2+及滲透壓穩(wěn)定劑的完全培養(yǎng)基。 檢出融合細胞。 外源基因命運 1、具備復制的必要因子,能在受體細胞中堅持下去并進行復制,發(fā)展成部分二倍體無性系。 2、流產轉導。 3、被酶解—寄主限制。 4、重組。 二、真核微生物基因重組 (一)有性雜交 一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生染色體重組,并產生新遺傳型后代的一種方式。 常見有性孢子。 (二)準性生殖parasexual reproduction 類似于有性生殖但更為原始的一種生殖方式。可使同一生物的兩個不同來源的體細胞經融合后,不通過減數(shù)分裂而導致低頻率的基因重組。 主要過程:圖8-37 1、菌絲聯(lián)結、質配。 2、形成異核體。 3、核配。 4、體細胞交換和單倍體化。 體細胞中染色體交換—有絲分裂交換:雙倍體雜合子遺傳性狀不穩(wěn)定,進行有絲分裂過程中,極少數(shù)核中染色體會發(fā)生交換和單倍體化,而形成具有新性狀的單倍體雜合子。 有性生殖與準性生殖區(qū)別:表8-12 準性雜交 主要步驟:圖8-38 1、選擇親本:要有選擇性標記。 2、強制形成異核體。 3、移單菌落。 4、檢驗穩(wěn)定性。 5、促進變異。然后篩選。 歸納總結:表8-10 基因工程 gene engineering 5節(jié):菌種衰退、復壯和保藏 一、衰退與復壯 對產量性狀而言,菌種的負變就是衰退,其他原有典型性狀變得不典型了,也是衰退。 一個重要原因是基因突變,與控制生產性狀有關的基因負變造成生產性狀劣化。培養(yǎng)、保藏條件等也有影響。 (一)衰退的防止 1、控制傳代次數(shù); 2、創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件; 3、利用不同類型細胞進行接種傳代; 4、采用有效的菌種保藏方法,加強菌種管理措施。 (二)復壯 1、純種分離 2、通過宿主體進行復壯(寄生性微生物) 3、淘汰已退化個體 二、菌種保藏 首先挑選典型優(yōu)良純種,其次創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境條件,還要考慮方法的通用性與簡便性。 1、低溫保藏:冰箱、超低溫。 2、干燥保藏:土壤、細砂、硅膠等。 3、隔絕空氣保藏:石蠟油封。 4、凍干保藏:綜合低溫、干燥、真空。 5、活體保藏:病原微生物、病毒。 實驗室常用方法: 菌種保藏機構簡介 中國微生物菌種保藏管理委員會CCCCM 1、普通微生物菌種保藏管理中心 中科院北微所(AS):真菌、細菌 武漢病毒所(AS-IV):病毒 2、農業(yè)微生物菌種 農科院土肥所(ISF) 3、工業(yè)微生物菌種 食品發(fā)酵所(IFFI) 4、醫(yī)學微生物菌種 醫(yī)科院皮研所(ID):真菌 衛(wèi)生部檢定所(NICPBP):細菌 醫(yī)科院病毒所(IV):病毒 5、抗生素菌種 醫(yī)科院醫(yī)藥生物技術所(IA) 四川抗研所(SIA):新抗菌種 華藥抗研所(IANP):生產菌種 6、獸醫(yī)微生物菌種 農業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(CIVBP) 中國典型培養(yǎng)物收藏中心(武漢大學) 國外 美國典型菌種收藏所(ATCC) 美國農業(yè)部北方地區(qū)研究室(NRRL) 日本大阪發(fā)酵研究所(IFO) 荷蘭真菌中心收藏所(CBS) 法國里昂巴斯德研究所(IPL) 西德柯赫研究所(RKI) 蘇聯(lián)科學院微生物研究所(IM) 六章:微生物生態(tài)與環(huán)境保護 (自然條件下的微生物) 生物圈 biosphere :地球上有生命活動的范圍,是地球上全部生活有機體與其環(huán)境相互作用的統(tǒng)一整體。是所有生態(tài)系統(tǒng)的總和。 微生物生態(tài):研究處于環(huán)境之中的微生物,和與微生物相聯(lián)系的物理、化學和生物等環(huán)境條件,以及它們之間的關系。 生態(tài)系 ecosystem :生物與其生境通過能量流動和物質循環(huán)所組成的一個整體結構。生物群落是核心。 1節(jié):自然界中的微生物 一、土壤中微生物 土壤是自然界最適宜微生物生長的環(huán)境,具有微生物所需一切營養(yǎng)物及各種條件。種類主要是異養(yǎng)型種類。 二、水中微生物 種類和數(shù)量要比土壤中少得多。 淡水中微生物主要來源于土壤、空氣、污水或死亡腐敗的動植物體。海水中微生物總量超過陸地。 飲用水標準:每ml水細菌總數(shù)不超過100個,E. coli每升水不超過3個。 三、空氣中微生物 空氣非微生物生長良好環(huán)境。微生物通過各種方式傳入空氣,又隨風傳播。 數(shù)量取決于環(huán)境。 潮濕空氣中微生物比干燥空氣中少,因為潮濕空氣中微生物被小水滴帶著沉降下去了。 空氣中菌數(shù)測定:過濾收集,培養(yǎng)計數(shù)。 四、極端環(huán)境微生物 了解這些微生物,可以利用其特殊基因、機能,創(chuàng)造有用新種。 2節(jié):微生物間以及與其他生物間的關系 生物間關系: 一、微生物間關系 1、互生:較松散聯(lián)合,可以是一方得利,或雙方有利。(混菌培養(yǎng)) 2、共生:緊密結合在一起,高度發(fā)展時,形成特殊共住體,生理上有分工,組織、形態(tài)上產生新結構。 地衣:藻類 + 真菌 3、寄生:一種生物生活在另一種生物表面或體內,從后者獲得營養(yǎng)。 4、拮抗:一種生物產生不利于另一種生物生存的代謝物質或改變環(huán)境條件,抑制甚至殺死另一種生物的現(xiàn)象。 5、捕食:一種生物直接吞食另一種生物。 二、與高等植物關系 共生:根瘤菌,菌根菌 互生:根際微生物 寄生:植物病原微生物 三、與人及動物關系 共生:瘤胃微生物,白蟻 互生:人體腸道正常菌群 寄生:病原微生物,寄生于昆蟲(生物殺蟲劑) 擇生生物(悉生生物):接種有一種或多種已知微生物的無菌動物。 3節(jié):微生物與自然界中的物質循環(huán) 物質循環(huán):一切生物將所需重要化學元素自非生命物質狀態(tài)轉變?yōu)橛猩奈镔|狀態(tài),再自有生命的物質狀態(tài)轉變?yōu)榉巧奈镔|狀態(tài),如此循環(huán)不已。 微生物既是分解者、消耗者,又是生產者。 一、碳素循環(huán) 微生物作用:1)光和作用 2)分解作用 大氣二氧化碳(0.02%)約6000億噸,植物光合作用年消耗600到700億噸,燃燒年產生50~60億噸,人和動物呼吸產生的二氧化碳僅夠植物光合作用一個月之需,90%二氧化碳由微生物代謝活動產生。 經光合作用固定地二氧化碳,大部分以聚糖形式累積在木本、草本內。 二、氮素循環(huán) 分子態(tài)氮、有機態(tài)氮、無機態(tài)氮 圖9-6。微生物作用:固氮、硝化、反硝化、氨化、氨同化 三、硫素循環(huán) 元素態(tài)、無機化合態(tài)、有機態(tài) 圖9-7。微生物作用:脫硫、硫酸鹽還原作用(同化性、異化性)、硫化(無機硫氧化)。 四、磷素循環(huán) 自然界無機磷主要是磷酸鈣,有機磷主要是核蛋白、核酸、卵磷脂等,都是非溶性的。 轉變?yōu)榭扇苄,主要是微生物作用?BR>4節(jié):微生物與環(huán)境保護 當有害物質濃度超過了生態(tài)系統(tǒng)的凈化能力時,就會造成對生態(tài)系統(tǒng)結構和機能的破壞,打破生態(tài)系統(tǒng)的平衡,使人類生活的環(huán)境發(fā)生變化,此即環(huán)境污染。 一、微生物對污染物的降解與轉化 1、主要污染物 無毒有機物:易被生物降解; 有毒有機物:不易被生物降解。 無毒無機物:一些營養(yǎng)性無機鹽; 有毒無機物:重金屬等Hg As Pb Cd。 2、微生物的降解與轉化 對無機污染物的轉化 微生物不能降解重金屬,只能使它們發(fā)生形態(tài)之間的相互轉化及分散和富集過程。也就是改變金屬在環(huán)境中的存在轉態(tài),從而改變它們的毒性 有機Hg Pb 無機Hg Pb 對有機污染物的降解 農藥:主要通過催化作用使農藥分子發(fā)生一些結構改變,使其被分解。 石油:多種烴類混合物,多種微生物共同作用, 二、水污染及防治 1、水的污染源 污染指標: COD(化學需氧量):使用強氧化劑(高錳酸鉀、重鉻酸鉀)使1L污水中的有機物進行化學氧化時所消耗的氧的毫克數(shù)。mg/L BOD5(五日生化需氧量):20℃時,每L廢水所含有機物在5天內進行微生物氧化時所消耗的氧量,mg/L。 2、處理廢水的微生物法 (1) 厭氧處理法(產能型) 采用厭氧消化器把微生物可降解的有機物轉化成甲烷、二氧化碳、水和其它氣體的一種處理方法。 過程:三個階段,圖9-11:涉及到的微生物,發(fā)生的反應。 (2) 好氧處理法 過程 ①活性污泥法(曝氣法)(耗能型):利用含有好氧微生物的活性污泥,在通氣條件下,使污水凈化的生物學方法。 活性污泥是一種絮狀污泥,主要是菌膠團形成菌,原生動物,有機和無機膠體以及懸浮物組成。人工培養(yǎng)、馴化獲得。 根據(jù)污水在系統(tǒng)中流動狀況分為推流式和完全混合式。 ②生物膜法:以好氧微生物組成的生物膜為凈化主體的生物處理方法。 A、滴濾池法(節(jié)能型)(灑水濾床法) B、生物轉盤法(耗能型) ③氧化塘法(節(jié)能型)(穩(wěn)定塘):大面積敞開式污水處理池,利用藻菌互生系統(tǒng)來分解有機物,使污水得以凈化。 固體廢物采用堆肥法和沼氣發(fā)酵法。 七章:傳染與免疫 1節(jié):傳染 infection 非傳染性:生理性、遺傳性等 疾病 病原微生物(病毒、細菌) 傳染性 其它生物(寄生蟲等) 傳染是病原微生物侵入機體后,在機體一定部位生長繁殖,并引起一系列病理生理的過程。 傳染是宿主、病原菌、環(huán)境因素三方面力量作用的結果。
一、傳染的三種可能結局 1、隱性傳染 2、帶菌狀態(tài) 3、顯性傳染 傳染病專指顯性傳染。 二、決定傳染結局的三個因素 (一)病原微生物在傳染免疫中作用 要造成感染,必須能抵抗機體內的天然防御機能而不被消滅,并在侵入體內后能生長繁殖,擾亂機體的新陳代謝,造成傳染。 要具備一些條件才能傳染(P320) 1、毒力或致病性 某種微生物對一定宿主,在一定條件下引起疾病的能力。 強弱取決于以下因素: 1)侵襲力:與酶(卵磷脂酶、透明質酸酶、膠原酶、鏈激酶、凝固酶)和微生物結構(莢膜、菌毛、表面抗原)有關。 2)毒素 ①內毒素:多由G-產生,化學組成為脂多糖。 ②外毒素:某些G+分泌到體外的毒性物質,化學組成為蛋白質。如破傷風毒素、肉毒毒素、白喉外毒素等。 外毒素可用0.3-0.4%甲醛脫毒,成為類毒素(仍保持抗原性)。 內、外毒素比較:P322,表10-1 2、數(shù)量 與毒力強弱有關。多數(shù)病原微生物需要足夠數(shù)量侵入機體,才能發(fā)病。 3、侵入途徑 不同菌侵入途徑不同,只有侵入易感機體的一定部位,才能發(fā)病。 (二)機體在傳染免疫中作用(宿主的免疫力) 1、免疫定義 Immune 機體對體內外生物性刺激的反應,在正常情況下機體識別異物、排除異物、消滅異物的生理功能。 或者說機體識別自己、排除異己抗原物質的一種生理功能。 既有有利一面,也有有害一面。 2、免疫反應分類 1)非特異性免疫與特異性免疫 非特異性免疫是機體對所有病原微生物都有防御作用,沒有特殊的選擇性。它受遺傳控制,是機體在長期的種系發(fā)育與進化過程中逐漸建立起來的一系列防衛(wèi)機能,在個體一出生就具有。 又稱天然免疫(先天免疫)
特異性免疫是指機體針對某一種或某一類微生物或其產物所產生的特異性抗力。 是個體在生活過程中通過隱性感染或預防接種等方式,使抗原與免疫系統(tǒng)的細胞相接觸后而獲得的防衛(wèi)機能。又稱后天獲得性免疫
2)自動免疫與被動免疫 自動免疫是指用人工方法注射抗原(菌苗、疫苗、類毒素),使機體產生免疫功能。 被動免疫是指用人工方法注射抗體(抗毒素、抗血清)而產生對病原體的抵抗力。
3)細胞免疫與體液免疫 細胞免疫是指致敏淋巴細胞與其相應抗原作用所產生的特異性免疫。 體液免疫是抗體的免疫作用。 3、免疫的功能 1)生理防御功能(免疫防御) 2)自身穩(wěn)定功能(免疫穩(wěn)定) 3)免疫監(jiān)視作用(及時排除突變細胞。) (三)環(huán)境因素 P325表解 2節(jié):非特異性免疫 一、機體的天然屏障作用 1、皮膚和粘膜(體外屏障) 2、內部屏障 二、吞噬細胞 白細胞分類:P327,表10-4,圖10-1 1、噬中性粒細胞:吞噬過程。圖10-2 2、巨噬細胞:來源、功能。
三、炎癥反應 四、體液因素(正常體液中的抗微生物因素):P330,表10-5 1、補體系統(tǒng) 補體是存在于正常血清中一組具有酶活性的蛋白,有補充抗體作用能力,其作用無特異性,可與抗原抗體復合物作用,不能單獨作用于抗原或抗體。補體由巨噬細胞、腸上皮細胞及肝、脾細胞產生。 補體系統(tǒng)由11個血清蛋白構成,C1-C9,C1又分C1q、C1r、C1s。是一組酶原,被激活后發(fā)揮作用。 補體攻擊細胞結果,使膜損傷,導致細胞裂解。促進吞噬作用。與變態(tài)反應有關。 (2)干擾素 interferon IFN 干擾素是一類在同種細胞上具有抗病毒活性的蛋白質,其活性發(fā)揮又受細胞基因組的調節(jié)和控制,涉及到RNA和蛋白質合成。 人干擾素有α干擾素(白細胞干擾素),β干擾素(成纖維細胞干擾素),γ干擾素(免疫干擾素)。 干擾素誘生劑:P331 天然干擾素是分子量為2萬的糖蛋白,其作用無特異性,但產生干擾素的動物和被保護的動物之間卻有種屬特異性。不過也有交叉保護作用。干擾素作用時間短,僅幾天。 作用機制:P331,圖10-3 主要抑制病毒的復制,其可激活宿主DNA,產生抗病毒蛋白(AVP),與核糖體作用,使其只能合成宿主蛋白,而不能合成病毒蛋白。 3節(jié):特異性免疫 一、參與特異性免疫的組織器官 胸腺、腔上囊、骨髓、淋巴結、脾臟。前三者稱中央淋巴組織,后二者稱外周淋巴組織。 二、參與特異性免疫的細胞 免疫活性細胞是指在免疫過程中受抗原刺激后能進行分化、增殖并發(fā)生特異性免疫應答的T、B細胞。 免疫細胞主要是各類淋巴細胞、巨噬細胞等 免疫細胞均來源于骨髓干細胞。
1、干細胞:分化圖 P336,圖10-5 2、T淋巴細胞(胸腺依賴淋巴細胞) T細胞發(fā)育過程(細胞免疫) T細胞表面標志:綿羊紅細胞(sRBC)受體、有絲分裂原受體等。 T細胞分類: T調節(jié)細胞 輔助性T細胞(TH) (TR) 抑制性T細胞(TS) T效應細胞 遲發(fā)型超敏T細胞(TD) (TE) 細胞毒T細胞(TC)
2、B淋巴細胞(骨髓依賴淋巴細胞) 發(fā)育過程:體液免疫 標志:膜表面免疫球蛋白SmIg。 還有一些淋巴細胞,如K細胞、NK細胞等。 3、巨噬細胞 在特異性免疫中,淋巴細胞不易直接接觸抗原,須經巨噬細胞吞噬消化,將抗原信息傳遞給淋巴細胞。此外,巨噬細胞還能釋放白細胞介素-1,參與免疫。 三、特異性體液免疫 由抗體介導的免疫 1、中和外毒素 2、調理作用 3、凝集作用 4、阻止病原菌對粘膜的吸附
四、特異性細胞免疫 致敏T淋巴細胞介導的 1、 TD細胞的作用:釋放淋巴因子,其作用于免疫活性細胞而產生免疫效應。 主要的淋巴因子:表10-8 淋巴因子作用無特異性,但其釋放需特異性抗原刺激。 2、 TC 細胞作用:能特異性地識別靶細胞表面抗原,與其結合,使其溶解。
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