2015年臨床醫(yī)師考試微生物學(xué)重點(diǎn)講義：病毒的培養(yǎng)
病毒研究的發(fā)展常常與病毒培養(yǎng)和檢測方法的進(jìn)步有密切的關(guān)系，特別在脊椎動(dòng)物病毒方面，小鼠和雞胚接種、組織培養(yǎng)、超速離心、凝膠電泳、電子顯微鏡和免疫測定等技術(shù)，對病毒學(xué)的發(fā)展具有深刻的影響。
噬菌體的培養(yǎng)和檢測方法最為簡單。將噬菌體接種到易感細(xì)菌的肉湯培養(yǎng)物中，經(jīng)18～24小時(shí)后，混濁的培養(yǎng)物重新透明，此時(shí)細(xì)菌被裂解，大量噬菌體被釋放到肉湯中，再經(jīng)除菌過濾，即為粗制噬菌體。為了測定其中噬菌體的數(shù)量，將粗制噬菌體稀釋到每一接種量含100個(gè)左右，與過量的細(xì)菌混合，然后鋪種于瓊脂平皿上，在溫箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)菌繁殖成乳白色襯底，被噬菌體裂解的區(qū)域則在此襯底上表現(xiàn)為圓形的透明斑，稱為噬斑。醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn噬斑數(shù)代表該接種量中有活力的噬菌體數(shù)量。如果挑出單個(gè)噬斑來培養(yǎng)，就能獲得由單個(gè)噬菌體所繁殖的后代，達(dá)到分離純化的目的。
動(dòng)物病毒(見脊椎動(dòng)物病毒)的培養(yǎng)可在自然宿主、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行，以死亡、發(fā)病或病變等作為病毒繁殖的直接指標(biāo)，或以血細(xì)胞凝集、抗原測定等作為間接指標(biāo)。收獲發(fā)病動(dòng)物的組織磨成懸液或有病變的細(xì)胞培養(yǎng)液，即為粗制病毒。測定活病毒數(shù)量可采用空斑法，其原理與噬斑法相同，但以易感的動(dòng)物單層細(xì)胞代替細(xì)菌，在接種適當(dāng)稀釋的病毒后，用含有培養(yǎng)液和中性紅的瓊脂覆蓋，使病毒感染局限在小面積內(nèi)形成病變區(qū)，襯底的健康細(xì)胞被中性紅染成紅色，病變區(qū)不染色而顯示為空斑。
至今植物病毒的培養(yǎng)和檢測大都是在整株植物上進(jìn)行的。從搗碎的病葉汁中制備病毒，常用枯斑法檢測。醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn用手指蘸上混有金剛砂的稀釋病毒在植物葉片上軒輕摩擦，經(jīng)一定時(shí)間后出現(xiàn)單個(gè)分開的圓形壞死或退綠斑點(diǎn)，稱為枯斑。
除了利用病毒的致病性定量檢測病毒外，還可應(yīng)用物理方法，如在電子顯微鏡下計(jì)數(shù)病毒顆粒，或用紫外分光光度計(jì)測定提純病毒的蛋白和核酸量，這些方法所測得的數(shù)據(jù)包括了有感染性和無感染性的病毒粒。
應(yīng)用電子顯微鏡不但能看清病毒粒的大小、形態(tài)，還可以分辨其表面的蛋白亞單位和內(nèi)部的核殼等超微結(jié)構(gòu)。
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