1 中和用病毒懸液的制備
要求中和用病毒懸液經(jīng)37℃水浴作用1小時(shí)的LD50在32～320之間。
1.1病毒株的選擇：選用CVS毒種。
1.2 病毒株的傳代：取CVS毒種（一般為凍干毒種)制成10-2懸液，腦內(nèi)接種體重10～12g健康小白鼠0.03ml，待發(fā)病后取腦再制成10-2懸液，接種于小白鼠腦內(nèi)進(jìn)行傳代，一般傳至2～3代即可制成凍干中和用病毒或–70℃凍存的中和用病毒，但要選用小白鼠在第5天發(fā)病并麻痹的服制備。
1.3 凍干病毒的制備：用第5天發(fā)病并麻痹的鼠腦以脫脂牛乳研磨稀釋成20%的腦懸液，按0.5ml分裝安瓿凍干后真空封口，存gydjdsj.org.cn/yaoshi/-30℃待用。
1.4-70℃凍存病毒的制備：用第5天發(fā)病并麻痹的鼠腦用20%小牛血清磷酸鹽緩沖液研磨稀釋成10-1懸液，經(jīng)2000r/min20分鐘沉淀，取上清混勻后分裝小管，存-70℃冰箱待用。
1.5 病毒懸液的預(yù)測(cè)
1.5.1凍干病毒的預(yù)測(cè)：取含20%腦懸液的凍干病毒，啟開(kāi)后加入含2%小牛血清PBS1.0ml，吹打均勻后再用4.0ml上述稀釋液與病毒液充分混勻，1500r/min沉淀10分鐘，取上清與等量的稀釋液混合則為10-2懸液，然后再用10-3、10-4、10-5、10-6稀釋，從10-6至10-2各取0.5ml加入5個(gè)小管內(nèi)，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴一小時(shí)。用體重10~12g小白鼠30只，分成5組，每組6只，經(jīng)用37℃作用的10-6至10-2病毒懸液接種小白鼠，每個(gè)稀釋度接種6只小白鼠，每只小白鼠腦內(nèi)接種0.03ml，觀察14天，每天觀察小白鼠發(fā)病死亡情況，接種后4天內(nèi)死亡的小白鼠按非特異性死亡計(jì)。以接種5天后的發(fā)病死亡小白鼠統(tǒng)計(jì)LD50。
1.5.2-70℃凍存病毒懸液的預(yù)測(cè)：取含10%腦懸液的冰凍病毒用流水融化后即為10-1懸液，然后再做10-2至10-7稀釋。從10-7至10-3各取0.5ml加至5個(gè)小管內(nèi)，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴1小時(shí)，用體重10～12g小白鼠30只，分成5組，每組6只，用經(jīng)37℃作用的10-7至10-3病毒懸液接種小白鼠，每個(gè)稀釋度接種小白鼠6只，每只小白鼠腦內(nèi)接種0.03ml，觀察14天，每天觀察小白鼠發(fā)病死亡情況。接種后4天內(nèi)死亡的小白鼠按非特異性死亡計(jì)。以接種5天后的發(fā)病死亡小白鼠統(tǒng)計(jì)LD50。
1.5.3按以上二種病毒的懸液預(yù)測(cè)的結(jié)果計(jì)算LD50。將用其100個(gè)LD50的病毒稀釋度作為中和用病毒懸液稀釋倍數(shù)，用于小白鼠中和試驗(yàn)。
2 小白鼠的準(zhǔn)備
用作中和試驗(yàn)的gydjdsj.org.cn小白鼠必須是未進(jìn)行過(guò)其他試驗(yàn)的健康小白鼠，體重為10～12g。
3 中和試驗(yàn)
3.1狂犬病血清中和試驗(yàn)用的血清參考標(biāo)準(zhǔn)品：由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，或用經(jīng)檢定所認(rèn)可的各生產(chǎn)單位工作用參考標(biāo)準(zhǔn)品。
3.2待檢定血清樣品的稀釋：取有代表性的血清樣品，按二倍連續(xù)稀釋的方法用2%小牛血清PBS進(jìn)行稀釋，一般可采用1∶800、1∶1600…1∶102400，但可根據(jù)血清實(shí)際效價(jià)的情況適當(dāng)減低或提高試驗(yàn)時(shí)最低稀釋倍數(shù)，如采用上述8個(gè)稀釋倍數(shù)，則用待檢血清按2.7ml稀釋液加入0.3ml血清作為1∶10，然后再用3.5ml稀釋液加入混勻的1∶10倍的血清0.5ml為1∶80，再按2.7ml稀釋液加入0.3ml為1∶800。然后均按0.5ml加0.5ml稀釋的方法制成1∶800、1∶1600…1∶1024008個(gè)稀釋倍數(shù)，以上8個(gè)稀釋倍數(shù)的不同稀釋度分別以0.5ml加入8個(gè)小試管內(nèi)待用。
3.3 效價(jià)檢定用血清標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：方法同待檢血清樣品的稀釋。如用檢定所的85RS國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋度應(yīng)從1∶80開(kāi)始，其國(guó)際單位為26.53/ml。
3.4 中和用病毒懸液的制備：按病毒懸液預(yù)測(cè)的100個(gè)LD50的稀釋度作為中和用病毒懸液。
3.5 中和：將上述3.2項(xiàng)的8個(gè)稀釋度的各裝0.5ml的8支小試管和3.3項(xiàng)的8個(gè)稀釋度的各裝0.5ml的8支小試管共16支小試管各加入中和用病毒懸液0.5ml，放置37℃水浴1小時(shí)，作注射小白鼠用。另用相同體重的小白鼠測(cè)定中和用病毒懸液的實(shí)際LD50。其方法可將中和用病毒懸液作為原液再稀釋10-1、10-2、10-3四個(gè)稀釋度，以上4個(gè)稀釋度各加入0.5ml于小管內(nèi)，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，同樣放置37℃水浴1小時(shí)作為中和病毒對(duì)照。
3.6接種小白鼠：將已中和的待檢血清和血清標(biāo)準(zhǔn)品的不同稀釋度的懸液和病毒對(duì)照接種小白鼠，血清按從濃到稀的倍數(shù)接種小白鼠，而病毒對(duì)照則按從稀到濃的倍數(shù)接種小白鼠。每只小白鼠腦內(nèi)接種0.03ml。
3.7 觀察：共觀察14天，每天記錄小白鼠的發(fā)病死亡情況，接種后4天死亡的小白鼠作為非特異性死亡計(jì)。
4 待檢血清效價(jià)
按下列公式計(jì)算：
相對(duì)效力=待檢血清ED50的倒數(shù)/血清標(biāo)準(zhǔn)品ED50的倒數(shù)
血清效價(jià)（IU/ml)=相對(duì)效力×血清標(biāo)準(zhǔn)品的國(guó)際單位
