原位雜交組化（ISHH)與免疫組織化學（IHC)結合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或兩個相鄰切片進行染色，這樣就可以同一細胞中顯示出某種mRNA和相應的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因gydjdsj.org.cn/zhuyuan/的轉錄和蛋白、多肽合成的動力學。ISHH與IHC結合法可以在相鄰切片上分別進行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上進行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都獲得理想的結果，易成功，但易產(chǎn)生空間誤差和樣本誤差。在同一切片上進行結合法可克服這些誤差，但第一次染色總要或多或少地影響第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色過程中污染有少量RNase的液體所降解，因而在實踐中往往首先進行原位雜交組化染色，這種次序使結合法易成功。但在操作方法中應注意減少生物活性肽或蛋白的丟失，如在雜交后沖洗中適當減低漂洗溫度。
（1)切片入PBS沖洗5min，最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。
（2)0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
（3)0.4%Triton X-100 PBS 15min。
（4)1μg/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。
（5)4%多聚甲醛PBS固定5min 。
（6)PBS沖洗2×3min。
（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配)10min。
（8)2×SSC沖洗10min。
（9)雜交：如是cDNA探針用前需進行變性處理，載片法時將切片在空氣中晾干，加含探針的雜交液10μl于切片上，蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當大小看蠟膜，3H標記探針每10μl雜交液含1×105cpm探針，32P或35S標記探針每10μl雜交液含5×105cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干，然后入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43℃保溫12～16h。
（10)4×SSc 37℃沖洗10～30min。
（11)2×SSC（如為RNA探針則含20μg/ml RNase)37℃沖洗30min。
（12)1×SSC和0.1×SSc 37℃分別沖洗30min。
（13)PBS沖洗2×5min。（轉錄ISHH)
（14)0.5%H2O2PBS室溫30min。
（15)1%BSA 37℃，30min 。
（16)第一抗體，4℃孵育16～24h。
（17)PBS沖洗4×5min。
（18)第二抗體37℃，1h。
（19)PBS沖洗3×5min。
（20)兔PAp 37℃，1h 。
（21)PBS沖洗3×5min。
（22)DAB顯色液5～10min（DAB顯色液：0.05%DAB + 0.03% H2O2PBS液配)。
（23)PBS沖洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼于涂有粘附劑的載片上，晾干。
（24)切片入70%，85%，95%和2個100%酒精脫水，空氣干燥。
（25)在暗室涂布乳膠（乳膠配制：乳膠原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1)，晾干，裝入自顯影暗盒。
（26)4℃曝光：3H標記探針4～8周，35S標記探針1～4周，32P標記探針7～10天。
（27)D196顯影液，20℃顯影5～10min。
（28)自來水沖洗數(shù)秒。
（29)F5堅膜定影液10min。
（30)自來水沖洗15min。
（31)切片溫箱烤干，脫水，透明，封片。
結果：蛋白或多肽免疫反應陽性細胞為棕色胞質，而其相應mRNA為黑色銀顆粒聚集。
非同位素標記物很多例如：生物素（biotin)，地高辛（Digoxigenin)，汞（mercury)，溴（bromine)和堿性磷酸酶等，其中目前應用最多的是生物素和地高辛。將此法與免疫組化PAP法或ABC法聯(lián)合使用，能成功地顯示一些神經(jīng)肽mRNA和神經(jīng)肽的共存與共同分布。向正華等發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶抗地高辛抗體是經(jīng)木瓜蛋白酶處理的，只有抗體的Fab段沒有Fc段，而免疫細胞化學（Immunocytochemistry,ICC)所應用的抗體既有Fab段，又有Fc段。由于抗體的這一特性可在ISHH和ICC抗體孵育時將檢測核酸的抗地高辛抗體Fab段與檢測蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，這樣可明顯縮短ISHH和ICC結合法的實驗周期，同時還可以減少實驗過程中對ICC檢測的蛋白、多肽的損害，使結合法易成功。為什么兩種抗體可同時混合孵育切片，這是因為抗地高辛抗體只有Fab段，而沒有Fc段。我們知道抗體的抗原決定簇在Fc段，因此第二抗體與第一抗體的結合是第二抗體的Fab與第一抗體的Fc，所以第一抗體如果只有Fab段沒有Fc段，那么第二抗體就無法與一抗結合。因此實驗中將二種抗體混合孵育切片而不會產(chǎn)生交叉結合。以下為此法的原理圖（圖20-5)。
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圖20-5 原位雜交細胞化學與免疫細胞化學結合法
此種ISHH與ICC聯(lián)合法穩(wěn)定，實驗周期短，藍色與棕色反差強，是目前較好的ISHH與ICC結合法。詳細程序如下：
（1)將切片漂浮于能經(jīng)受高壓滅菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2沖洗3×5min。
（2)0.1mol/L甘氨酸PBS沖洗5min。
（3)0.4% Triton X-100 PBS 15min。
（4)1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配)，37℃保溫30min。
（5)4%多聚甲醛PBs 5min。
（6)PBS沖洗2×min。
（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配)10min。
（8)2×SSC沖洗10min。
（9)將切片用滅菌吸水紙吸干，然后入雜交液。核酸探針濃度為0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠腦冠狀切片15μl雜交液足夠。43℃保溫12～16h。
（10)4×SSc 37℃沖洗30min。
（11)2×SSC（含RNasea 20μg/ml)37℃保溫30min。
（12)1×SSC和0.5×SSc 37℃分別沖洗30min。
（13)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
（14)0.5%H2O2PBS室溫20min。
（15)0.05mol/l PBS 沖洗2×5min。
（16)堿性磷酸酶標記抗地高辛抗體（Fab)與抗蛋白或多肽等抗體混合液，前者一般1：1000稀釋，后者則因抗體而異。稀釋液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBSpH7.2，4℃孵育24h。
（17)0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
（18)二抗（1：100～1：200)37℃保溫1h。
（19)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
（20)PAP（1：200～1：400)37℃保溫1h。
（21)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
（22)DAB顯色液（0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配)顯色5～10min。
（23)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
（24)TSM，沖洗2×5min（TSM1：0.1mol/l Tris –gydjdsj.org.cn/wsj/ HCl pH8.0,0.1mol/LNaCl,0.01mol/L MgCl2).
（25)硝基四氮唑藍（400μg/ml)和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml)混合液（TSM2配顯色混合液)顯色1～3h，避光。
（26)20mmol/l EDTA終止顯色。
（27)將切片貼于涂有鉻礬明膠的載片上，空氣干燥。
（28)梯度酒精脫水，透明、封片。
結果：ISHH陽性細胞的胞質呈紫藍色，胞核不著色，示該細胞含XmRNA。ICC陽性細胞的胞質呈棕色，胞核不著色示該細胞含X多肽。雙標記細胞的胞質為藍棕混合色，示多肽與mR－NA共存于該細胞內。
