實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　PCR技術(shù)的原理

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的新方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即在高溫（95℃)下，待擴增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃)情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72℃)下，以引物3’端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3gydjdsj.org.cn/yaoshi/’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以2ⁿ的批數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過25～30個循環(huán)后，理論上可使www.med126.com基因擴增10⁹倍以上，實際上一般可達10⁶～10⁷倍。

圖22-1　PCR基本原理示意圖

假設(shè)擴增效率為“X”，循環(huán)數(shù)為“n”，則二者與擴增倍數(shù)“y”的關(guān)系式可表示為：y=(1+X)ⁿ。擴增30個循環(huán)即n=30時，若X=100%，則y=2³⁰=1073741824(>10⁹)；而若X=80%時，則y=1.8³⁰=45517159.6(>10⁷)。由此可見，其擴增的倍數(shù)是巨大的，將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外灶照射下（254nm)一般都可見到DNA的特異擴增區(qū)帶。