實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第一節(jié)　工具酶

基因工程的基本技術(shù)是人工進(jìn)行基因的剪切、拼接、組合�；�因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA線形分子片段準(zhǔn)確地切出來(lái)，需要各種限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease)；要把不同片段連接起來(lái)，需要DNA連接酶（ligase)；要結(jié)合基因或其中的一個(gè)片段，需要DNA酶（DNa polymerase)等。因此，酶是DNA重組技術(shù)中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶統(tǒng)稱(chēng)為工具酶。

一、DNA限制性?xún)?nèi)切酶

Lurva和Human（1952)以及Bertani和Weigle（1953)發(fā)現(xiàn)了噬菌體λ的限制作用，即用一種λ噬菌體在一種宿主細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但在另一種宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)很差，其原因在于它的DNA受到后一種宿主的“限制”。由此發(fā)現(xiàn)了限制-修飾系統(tǒng)。

各種細(xì)菌都能合成一種或幾種順序?qū)Ｒ坏暮怂醿?nèi)切酶。這些酶切割DNA的雙鏈，因?yàn)樗鼈兊墓δ芫褪乔懈頓NA，限制外源性DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，所以稱(chēng)這種核酸內(nèi)切酶為限制酶。合成限制酶的細(xì)胞自身的DNA可以不受這種酶的作用，因?yàn)榧?xì)胞還合成了一種修飾酶，它改變了限制酶識(shí)別的DNA順序的結(jié)構(gòu)，使限制酶不能起作用。限制-修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。如果用噬菌體去感染限制-修飾系統(tǒng)有活性的細(xì)菌，噬菌體DNA沒(méi)有先經(jīng)修飾，它與先經(jīng)修飾的噬菌體相比，感染效率要低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。未經(jīng)修飾的噬菌體DNA進(jìn)入細(xì)胞后被限制酶切成片段，片段的數(shù)目與DNA分子中限制酶的識(shí)別點(diǎn)數(shù)目成正比，這些片段進(jìn)一步被細(xì)胞的核酸外切酶降解，就會(huì)開(kāi)始裂解感染，由此產(chǎn)生的子代噬菌體全部帶有修飾過(guò)的DNA，因此能以很高的效率去感染另一些具有相同限制-修飾系統(tǒng)的細(xì)菌。目前，從各種生物中分離出的限制性?xún)?nèi)切酶已超過(guò)175種，其中80多種是切割DNA雙鏈。

（一)命名原則

限制性?xún)?nèi)切酶主要是從原核生物中提取的。現(xiàn)在通用的命名原則是：第一個(gè)字是細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母，第二、三個(gè)字是細(xì)菌種名的前二個(gè)字母，這些字母都用斜體字母；接下去是細(xì)菌株的第一個(gè)字母，用正體字母書(shū)寫(xiě)。如果同一菌株中有幾種不同的內(nèi)切酶時(shí)，則分別用羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……來(lái)代表�，F(xiàn)在列表舉例說(shuō)明如下（表23-1)。

表23-1 幾種限制性?xún)?nèi)切酶命名原則舉例

（二)分類(lèi)和特性

限制性?xún)?nèi)切酶主要分成三大類(lèi)。第一類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專(zhuān)一性，是隨機(jī)的。這類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中沒(méi)有多大用處，無(wú)法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類(lèi)酶如EcoB、EcoK等。

第二類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專(zhuān)一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，并能構(gòu)建來(lái)自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性?xún)?nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專(zhuān)一核苷酸順序最常見(jiàn)的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。如果識(shí)別位置在DNA分子中分布是隨機(jī)的，則識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性?xún)?nèi)切酶每隔46（4096)個(gè)核苷酸就有一個(gè)切點(diǎn)。人的單倍體基因組據(jù)估計(jì)為3×199核苷酸，識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性?xún)?nèi)切酶的切點(diǎn)將有（3×109/2.5×102)約107個(gè)切點(diǎn)，也就是可被這種酶切成107片段，識(shí)別6個(gè)核苷酸的限制性?xún)?nèi)切酶也將有（3×109/4×103)約106個(gè)切點(diǎn)。

第二類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱(chēng)順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱(chēng)軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱(chēng)為粘性末端。如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?/p>

↓ |

5’……GAA | TTC……3’

3’……CTT | AAG……5’

| ↑

垂直虛線表示中心對(duì)稱(chēng)軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome)。實(shí)線剪頭表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，可通過(guò)形成氫鍵而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如HaeⅢ的識(shí)別位置是：

↓

5’……GG↓CC……3’

3’……CC↓GG……’

↑

在箭頭所指處切割，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA片段是：

5’……GG CC……3’

和

3’……CC GG……5’

有時(shí)候兩種限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性?xún)?nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識(shí)別順序都是5’……GCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱(chēng)為同切酶或異源同工酶（isoschizomer)。

第三類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶也有專(zhuān)一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱(chēng)的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。因此，這種限制性?xún)?nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對(duì)于克隆基因或克隆DNA片段沒(méi)有多大用處。

二、甲基化酶

細(xì)胞的限制-修飾系統(tǒng)中的修飾作用是由甲基化酶（methylase)來(lái)完成的。甲基化酶同限制性?xún)?nèi)切酶具有完全相同的識(shí)別順序。甲基化酶使識(shí)別順序中的某個(gè)堿基發(fā)生甲基化，保護(hù)DNA不被限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)。

真核生物中目前只發(fā)現(xiàn)5-甲基胞嘧啶（M5C)。M5C占整個(gè)胞嘧啶中的2～7%（果蠅和某些昆蟲(chóng)例外)。M5C大多以M5CpG的形式存在，不同物種或同一物種的不同組織中，M5C出現(xiàn)的頻率也不盡相同。目前已經(jīng)純化作為商品出售的甲基化酶見(jiàn)表23-2。

將限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶同時(shí)作用，可使有幾種可能識(shí)別順序的限制性?xún)?nèi)切酶只對(duì)其中一種識(shí)別順序有效。例如限制性?xún)?nèi)切酶AvaⅠ的識(shí)別順序是：

5’……CPyCGPuG……3’

3’……GPuGCPyC……5’

Py可以是任何一種嘧啶，pu可以是任何一種嘌呤。因此可以有4種識(shí)別順序。如果同時(shí)使用甲基化酶TaqⅠ和甲基化酶HpaⅡ，則AvaⅠ的識(shí)別順序?qū)⒅皇?’……CCCGAG……3’�，F(xiàn)用圖解說(shuō)明（圖23-1)。

如果有一個(gè)DNA片段，有AvaⅠ的3個(gè)識(shí)別順序，當(dāng)用AvaⅠ處理后可得4個(gè)片段�？墒�，如果先用TaqⅠ甲基化酶和HpaⅡ甲基化酶使DNA順序中的有些堿基甲基化，然后再用AvaⅠ去切，結(jié)果只有1個(gè)識(shí)別順序可被AvaⅠ作用，只產(chǎn)生2個(gè)DNA片段。

圖23-1 幾種限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化的堿基

表23-2　甲基化酶及甲基化的堿基

*表示甲基化

三、分子克隆化的另一些酶

（一)DNA聚合酶

（DNa polymerase)的作用是將1個(gè)脫氧三磷酸核苷酸加到引物（primer)的3’-OH上www.gydjdsj.org.cn/yaoshi/，釋放出一個(gè)焦磷酸分子（ppi)，如下式表示。

聚合酶主要有以下幾種：

1．大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶（E.ColiDNA polymerase)主要有3種作用：①5’→3’的聚合作用。但不是復(fù)制染色體而是修補(bǔ)DNA，填補(bǔ)DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中摻入的錯(cuò)誤核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受損傷的DNA。它在切口平移（nick translation)中的應(yīng)用，將在下面介紹。

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一個(gè)片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填補(bǔ)DNA單鏈末端成為雙鏈。如果供給32P標(biāo)記的三磷酸核苷酸，則可使DNA帶上同位素標(biāo)記。當(dāng)用交錯(cuò)切割的限制酶切成帶有單鏈粘性末端的DNA片段，要用被切成平頭末端的DNA片段連接時(shí)，可以先用Klenow片段使粘性末端的單鏈補(bǔ)齊成為平頭，然后在DNA連接酶作用下把兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)。

另外還有大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ。前者不能利用單鏈DNA或poly(dA-dT)為模板。需有鎂離子和dNTP時(shí)才能表現(xiàn)出酶活性，無(wú)自發(fā)合成DNA的作用。后者沒(méi)有5’→3外切酶活性，也不能用單鏈DNA作為模板。

2．噬菌體DNA聚合酶這里以T4DNA聚合酶為例。它也具有5’→3聚合酶活性，但它的外切酶活性比大腸桿菌的要高200倍。因此，它也可用來(lái)補(bǔ)齊單鏈末端或標(biāo)記同位素。

（二)RNA聚合酶

RNA聚合酶（RNapolymerase)的作用是轉(zhuǎn)錄RNA。有的RNA聚合酶有比較復(fù)雜的亞基結(jié)構(gòu)。如大腸桿菌RNA聚合酶有四條多肽鏈，另有一個(gè)促進(jìn)新RNA分子合成的σ因子，因此它的組成的是α2ββσ。這種結(jié)構(gòu)稱(chēng)為全酶（holoenzyme),除去了σ因子的酶稱(chēng)為核心酶。噬菌體RNA聚合酶則沒(méi)有亞基。

真核生物的RNA聚合酶分三類(lèi)。RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁中，轉(zhuǎn)錄rRNA順序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄大多數(shù)基因，需要“TATA”框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄很少幾種基因如tRNA基因如5SrRNA基因。有些重復(fù)順序如Alu順序可能也由這種酶轉(zhuǎn)錄。上面提到的“TATA”框又稱(chēng)Goldberg –Hogness順序，是RNA聚合酶Ⅱ的接觸點(diǎn)，是這種酶的轉(zhuǎn)錄單位所特有的。它在真核生物的轉(zhuǎn)錄基因的5’端一側(cè)，在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游20至30個(gè)核苷酸之間有一段富含AT的順序。如以轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為0，則在-33到27個(gè)核苷酸與-27至21核苷酸之間，有一個(gè)“TATA”框。一般是7個(gè)核苷酸。RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄單位的典型結(jié)構(gòu)如圖23-2。原核生物中也類(lèi)似“TATA”框的結(jié)構(gòu)。RNA聚合酶作用在“TATAAT”（Pribnow)盒和“TTGA－CA”框附近。

圖23-2 反轉(zhuǎn)錄酶的作用機(jī)理

（三)反轉(zhuǎn)錄酶

反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcripatase)是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA（cDNA)的酶。哺乳類(lèi)C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類(lèi)B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥(niǎo)類(lèi)RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。這種酶需要鎂離子或錳離子作為輔助因子，當(dāng)以mRNA為模板時(shí)，先合成單鏈DNA（ssDNA)，再在反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以單鏈DNA為模板合成“發(fā)夾”型的雙鏈DNA（dsDNA)，再由核酸酶S1切成二條單鏈的雙鏈DNA。因此，反轉(zhuǎn)錄酶可用來(lái)把任何基因的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA拷貝，然后可大量擴(kuò)增插入載體后的cDNA。也可用來(lái)標(biāo)記cDNA作為放www.gydjdsj.org.cn射性的分子探針。

（四)核酸外切酶

大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exonucleaseⅢ)是從帶3’-OH末端的雙鏈DNA，按3’→5’方向切除5’單核苷酸：

大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ則是從單鏈DNA的3’端和5’端切除寡核苷酸（兩種形式)：

（1)（2)

前一種酶需要鎂離子作輔助因子才有活性；后一種酶則不需鎂離子，因此即使在有螯合劑EDTA的情況下也有活性。另一種從噬菌體λ感染的大腸桿菌中提取的λ核酸外切酶是從帶有5’磷酸末端的雙鏈DNA上，逐個(gè)切除5’單核苷酸，在反應(yīng)時(shí)需要鎂離子：

（五)核酸酶S1

核酸酶S1（nucleaseS1)主要是降解單鏈DNA或單鏈RNA。對(duì)單鏈DNA的活性更高。它的用途是切除DNA片段的單鏈末端使之成為平頭末端，切開(kāi)合成dscDNA時(shí)形成的“發(fā)夾”環(huán)以及分析DNA-RNA雜合子的結(jié)構(gòu)。

（六)DNA酶

DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ)是隨機(jī)水解雙鏈或單鏈DNA的一種內(nèi)切酶，使DNA分子降解成帶有5’磷酸末端的單核苷酸和寡核苷酸的混合物：

在進(jìn)行重組DNA研究時(shí)，必須注意防止DNA酶的污染，否則制備的DNA樣品將會(huì)降解。因此器皿或試劑高溫處理，樣品中加EDTA，或放置冰上以破壞或抑制酶活性。

（七)RNA酶

RNA酶A（ribonuclease A)作用于嘧啶核苷酸的3’磷酸根上，切開(kāi)與相鄰核苷酸連接的5’磷酸鍵。另一種RNA酶T1只作用于鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的3’磷酸根，切開(kāi)與相鄰核苷酸連接的5’磷酸鍵。人體的分泌物如唾液，汗液中都含有RNA酶。因此在操作RNA樣品時(shí)，必須戴手套，實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿都要經(jīng)250℃烘烤4h（RNA酶耐熱)，或用RNA酶的抑制劑處理。

（八)連接酶

最常用的是T4DNA連接酶（T４DNa ligase)，催化雙鏈DNA中相鄰的3’OH與5’磷酸根之間形成磷酸二酯鍵，它可用來(lái)連接具有粘性末端的兩個(gè)DNA片段，或連接兩個(gè)平頭末端的DNA片段，使之成為一個(gè)重組DNA分子�？墒沁@種酶只能連接雙鏈DNA而不能連接單鏈DNA分子。T4RNA連接酶則可在單鏈DNA分子或RNA分子的5’磷酸根和3’-OH之間催化生成共價(jià)鍵。

（九)末端轉(zhuǎn)移酶

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidetransferase)的作用是將脫氧核苷酸加到DNA分子的3’-OH末端。

（十)堿性磷酸酶

從DNA或RNA的三磷酸脫氧核糖核苷酸或三磷酸核糖核苷酸上除5’-磷酸根殘基。一般的用途是用這種酶處理DNA或RNA后，在5’端上標(biāo)記32P。在經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切DNA片段后，用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase)處理可以阻止酶切的片段自身連接，這在克隆DNA片段時(shí)特別有用。