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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)
1 試劑
1.1 消化液
1.1.1 1M 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH8.0)
三羥甲基氨基甲烷 12.11g
滅菌雙蒸水 80mL
濃鹽酸 調(diào)pH至8.0
滅菌雙蒸水 加至100mL
1.1.2 0.5M 乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液 (pH8.0)
二水乙二銨四乙酸二鈉 18.61g
滅菌雙蒸水 80mL
氫氧化鈉 調(diào)pH至8.0
滅菌雙蒸水 加至100mL
1.1.3 20% 十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液 (pH7.2)gydjdsj.org.cn
十二烷基磺酸鈉 20g
滅菌雙蒸水 80mL
濃鹽酸 調(diào)pH至7.2
滅菌雙蒸水 加至100mL
1.1.4 消化液配制
1M 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH8.0) 2mL
0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0) 0.4mL
20% 十二烷基磺酸鈉溶液(pH7.2) 5mL
5M 氯化鈉 4mL
滅菌雙蒸水 加至200mL
1.2 蛋白酶K溶液
蛋白酶K 5g
滅菌雙蒸水 加至250mL
1.3 酚/氯仿/異戊醇混合液
堿性酚 25mL
氯仿 24mL
異戊醇 1mL
1.4 2.5mmol/LdNTP
dATP(100mmol/L) 20µL
dTTP(100mmol/L) 20µLgydjdsj.org.cn
dGTP(100mmol/L) 20µL
dCTP(100mmol/L) 20µL
滅菌雙蒸水 加至800µL
1.5 8pmol/µL PCR引物
上游引物ATXU（2 OD)加入701µl滅菌雙蒸水溶解，下游引物ATXD（2 OD)加入697µL滅菌雙蒸水溶解，分別取ATXU、ATXD溶液各300µL，混勻即為8pmol/µL 擴(kuò)增引物。
1.6 0.5單位Taq DNA聚合酶
5單位Taq DNA聚合酶 1µL
滅菌雙蒸水 加至10µL
現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.7 10×PCR緩沖液
1.7.1 1mol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)( pH9.0)
三羥基甲基氨基甲烷 15.8g
滅菌雙蒸水 80mL
濃鹽酸 調(diào)pH至9.0
滅菌雙蒸水 加至100mL
1.7.2 10倍PCR緩沖液
1mol/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL
氯化鉀 0.373g
曲拉通X-100 0.1mLgydjdsj.org.cn
滅菌雙蒸水 加至100mL
1.8 溴化乙錠(EB)溶液
溴化乙錠 0.2g
滅菌雙蒸水 加至20mL
1.9 電泳緩沖液(50倍)
1.9.1 0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液 (pH8.0)
二水乙二銨四乙酸二鈉 18.61g
滅菌雙蒸水 80mL
氫氧化鈉 調(diào)pH至8.0
滅菌雙蒸水 加至100mL
1.9.2 TAE電泳緩沖液(50倍)
三羥基甲基氨基甲烷(Tris) 242g
冰乙酸 57.1mlL
0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液(pH8.0) 100mL
滅菌雙蒸水 加至1 000mL
用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋使用
1.10 1.5％瓊脂糖凝膠
瓊脂糖 3g
TAE電泳緩沖液(50倍) 4mL
滅菌雙蒸水 196mL
微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB)溶液20µL。
1.11 上樣緩沖液gydjdsj.org.cn
溴酚藍(lán)0.2g，加雙蒸水10mL過(guò)夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚藍(lán)溶液中，搖勻定容至100mL。
1.12 其它試劑
異丙醇(分析純)
70%乙醇
15mmoL/L氯化鎂
滅菌雙蒸水
