紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中篩選紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞株的方法
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公開(公告)號
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CN1139658C
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公開(公告)日
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2004.02.25
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申請(專利)號
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CN00117591.2
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申請日期
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2000.11.02
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專利名稱
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紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中篩選紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞株的方法
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主分類號
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C12N15/04
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分類號
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C12N15/04
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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梅縣梅雁生物工程研究所
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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李志良;黃巧明;張慶云;侯嵩生
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地址
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514787 廣東省梅縣嘉應(yīng)西路梅雁工業(yè)大樓三樓
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頒證日
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2004.02.25
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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代理人
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國省代碼
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廣東;44
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主權(quán)項(xiàng)
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一種紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中篩選紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞株的方法，其特征在于：(1)紅豆杉外植體用自來水洗凈后，用酒精和次氯酸鈉消毒，然后用蒸餾水清洗并截短至1～2厘米長，在其上劃有傷痕后接種到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～5周誘導(dǎo)獲得愈傷組織，愈傷組織在固體培養(yǎng)基上每20～25天繼代一次，繼代時(shí)，比較培養(yǎng)物的顏色、形態(tài)、含水量，選擇生長快、顏色淺、顆粒明顯的均勻細(xì)胞小粒進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行紫杉醇的定量分析，從中選出含量高的繼續(xù)培養(yǎng)；(2)經(jīng)初步篩選獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每10天繼代一次。待第3代培養(yǎng)3～15天后，取出靜置片刻，在無菌條件下將上層含有單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)液用吸管吸取，過150～250目篩，濾液為單細(xì)胞或有少數(shù)小細(xì)胞團(tuán)的懸液，然后對單細(xì)胞進(jìn)行看護(hù)培養(yǎng)；(3)看護(hù)培養(yǎng)是用經(jīng)15～20天保溫培養(yǎng)的同種紅豆杉鮮細(xì)胞以5～10g(dw)/L的量接種到固體培養(yǎng)基上，上面鋪濾紙，保溫培養(yǎng)3～7天后將單細(xì)胞懸液以100～1000個(gè)/cm2的密度接種到濾紙上保溫培養(yǎng)，以獲得克隆細(xì)胞；(4)選取塊狀或顆粒較明顯的克隆細(xì)胞，然后將選取的每一克隆細(xì)胞分為二部分，一部分每20～25天繼代一次，另一部分培養(yǎng)22～27天后進(jìn)行紫杉醇的定量分析，選出紫杉醇含量高的細(xì)胞株。
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摘要
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本發(fā)明涉及紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中篩選紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞株的方法。紅豆杉的外植體經(jīng)誘導(dǎo)得到愈傷組織，初步篩選后利用單細(xì)胞克隆方法獲得克隆細(xì)胞，再根據(jù)紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物的外觀特征與細(xì)胞中紫杉醇含量的相關(guān)性進(jìn)行篩選，最后對選到的細(xì)胞株進(jìn)行含量測定和穩(wěn)定性試驗(yàn)，獲得生長速率為0.52g(dw)/L.d、紫杉醇含量為0.1％的細(xì)胞優(yōu)株，紫杉醇含量較原植物提高了10倍。本發(fā)明具有簡便、快捷選取紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞株的特點(diǎn)，能節(jié)省大量人力、物力、提高勞動(dòng)生產(chǎn)率。
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國際公布
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