| 公開(公告)號 | CN1152965C |
| 公開(公告)日 | 2004.06.09 |
| 申請(專利)號 | CN98807440.0 |
| 申請日期 | 1998.06.15 |
| 專利名稱 | 利用復(fù)合競爭性逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)定量測定基因表達(dá)的方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68;B01L7/00;B01L3/00 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | 1997.6.16 US 08/876,766 |
| 申請(專利權(quán))人 | 俄亥俄醫(yī)學(xué)院 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | J·C·威利;E·L·克勞福德 |
| 地址 | 美國俄亥俄 |
| 頒證日 | 2004.06.09 |
| 國際申請 | PCT/US1998/012420 1998.6.15 |
| 進(jìn)入國家日期 | 2000.01.20 |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 樊衛(wèi)民 |
| 國省代碼 | 美國;US |
| 主權(quán)項 | 一種定量測定靶基因的基因表達(dá)的方法，它包括：(a)分離靶基因和持家基因的細(xì)胞mRNA，其經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄并在競爭性模板存在下被特異性擴(kuò)增，得到各靶基因與各持家基因之比，將該比值用于估計各靶基因的基因表達(dá)量，方法是通過進(jìn)行如下混合物的同時聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，混合物中含有下列成分：i)各靶基因的至少一個寡核苷酸引物對，ii)各持家基因的至少一個寡核苷酸引物對，iii)各靶基因的至少一個突變的競爭性模板，iv)各持家基因的至少一個突變的競爭性模板，及v)含有各靶基因cDNA的至少一個拷貝，和各持家基因cDNA的至少一個拷貝的天然cDNA；經(jīng)擴(kuò)增以形成聚合酶鏈反應(yīng)cDNA產(chǎn)物，其中含有：各靶基因與各持家基因的天然cDNA，和各靶基因與各持家基因的突變的cDNA；PCR反應(yīng)混合物中含有適量的不同靶基因的競爭性模板混合物各競爭性模板之間的濃度已知，還含有相對于靶基因定量的不同的持家基因，從而使被評估的靶基因與持家基因的天然和競爭性模板通過下列擴(kuò)增而測得，方法是：i)制備足夠的含有cDNA等份、競爭性模板混合物、各種dNTP、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和相應(yīng)于待測基因數(shù)目的緩沖液的母混合物；ii)將反應(yīng)混合物的等分樣品加入到置于冰上的反應(yīng)容器中，反應(yīng)容器的數(shù)目相應(yīng)于待測基因的數(shù)目，和iii)將待測基因的特異性引物的等分樣品加入到各反應(yīng)容器中，并將持家基因的引物加入一個單獨的管中，(b)分離cDNA產(chǎn)物；(c)通過將編碼各靶基因的天然cDNA的量和編碼靶基因競爭性模板的突變的cDNA的量，與編碼各持家基因的天然cDNA的量和編碼持家基因競爭性模板的突變的cDNA的量相比較，檢測天然cDNA產(chǎn)物和突變cDNA產(chǎn)物的相關(guān)存在量，其中比較靶基因與持家基因的天然cDNA產(chǎn)物和突變cDNA產(chǎn)物的量的相關(guān)存在量，提供了定量測定靶基因表達(dá)的方法；以及，(d)測定相應(yīng)于天然基因的PCR產(chǎn)物的譜帶密度與相應(yīng)于各基因的競爭性模板的PCR產(chǎn)物的譜帶密度之比；其中，對于各個基因，將靶基因的天然/競爭性模板的密度比除以持家基因的天然/競爭性模板的密度比，得到單位為mRNA/106β-肌動蛋白mRNA的最終值。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了通過復(fù)合競爭性逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)定量測定基因表達(dá)的方法及儀器。該方法和儀器特別適用于細(xì)胞和組織的小樣品分析。 |
| 國際公布 | WO1998/058083 英 1998.12.23 |
