| 公開(公告)號 | CN1699558A |
| 公開(公告)日 | 2005.11.23 |
| 申請(專利)號 | CN200510035036.4 |
| 申請日期 | 2005.06.09 |
| 專利名稱 | 使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術 |
| 主分類號 | C12N5/08 |
| 分類號 | C12N5/08 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 鄭麗琴 |
| 發(fā)明(設計)人 | 郭杰標 |
| 地址 | 512026廣東省韶關市芙蓉新城碧島豪庭A座804 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 韶關市雷門專利事務所 |
| 代理人 | 周勝明 |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權項 | 一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術，包括臍帶血造血干細胞的獲得，以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞、并完成對腫瘤抗原的提呈作用，完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活，以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備，CIK細胞的激活和CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)，其特征是：所述以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備是以共價方法將單抗連接在微載體上，提高單抗與細胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細胞密度，又可以在空間實現(xiàn)樹突狀細胞、輔助性T細胞、殺傷性T細胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細胞的選擇激活，由于CIK細胞培養(yǎng)實現(xiàn)立體化，所以可以使用生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)，將瓊脂糖微載體在pH為10.5-11的0.1MTris緩沖液中和加入溴化氰使終濃度為0.1M，在搖床上20-25℃作用過夜；1500轉/分鐘離心5分鐘，使瓊脂糖微載體和溴化氰反應液分離，用pH為11的Tris緩沖液洗滌/離心5次，將活化的瓊脂糖微載體風干備用，將瓊脂糖微載體和抗CD3抗體以1g/3-5mg的比例，在pH為9.5-10的0.1MTris緩沖液中混合，在搖床上20-25℃作用1小時，使抗CD3抗體充分結合到瓊脂糖微載體上，加入足夠量的甘氨酸封閉瓊脂糖微載體未反應的位點，用DMEM培養(yǎng)液洗滌離心10次，將微載體在4-8℃風干后，用鈷60輻照滅菌后備用；所述CIK細胞的激活是將完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活中處理過的臍帶血造血干細胞以0.8-1×108個細胞/1g微載體的比例混合，在培養(yǎng)瓶中以含有10％胎牛血清和終濃度為300-500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，這時臍帶血造血干細胞中含有的單核細胞和殺傷性T細胞會在連接和微載體上的抗CD3單抗和IL-2的作用下被激活成為CIK細胞，進入快速生長的狀態(tài)，在抗CD3單抗的支持下生長8-10天后，CIK細胞會逐漸成熟并擺脫對抗CD3單抗的依賴，這時可以將細胞轉入到生物反應器中進行大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)；所述CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)：采用攪拌式生物反應器，以攪拌速度60-80轉/分鐘，溶氧量為45-55％，pH為7.2，溫度為37℃，培養(yǎng)基替換速度為1-1.5ml/分鐘的條件進行培養(yǎng)，能夠為細胞提供穩(wěn)定而合適的生長條件，而反應器的細胞截留裝置使細胞能夠保持高密度狀態(tài)，使CIK細胞能夠得到長時間、高密度地培養(yǎng)，當反應器內的細胞密度達到3-5×107之后，就可以每天收集500-800ml的細胞培養(yǎng)液，得到2-4×1010的CIK細胞，剩余的細胞繼續(xù)在反應器內進行連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)收集。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術，包括臍帶血造血干細胞的獲得，以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞、并完成對腫瘤抗原的提呈作用，完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活，以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂堂微載體的制備，CIK細胞的激活和CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明以共價方法將單抗連接在微載體上，既提高了單抗與細胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細胞密度；又可以在空間實現(xiàn)樹突狀細胞、輔助性T細胞、殺傷性T細胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細胞的選擇激活；CIK細胞使用生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)。 |
| 國際公布 |
