| 公開(公告)號 | CN1869206A |
| 公開(公告)日 | 2006.11.29 |
| 申請(專利)號 | CN200610046748.0 |
| 申請日期 | 2006.05.27 |
| 專利名稱 | 一種高效免疫活性細(xì)胞群制備及用于抗腫瘤的方法 |
| 主分類號 | C12N5/08(2006.01)I |
| 分類號 | C12N5/08(2006.01)I;A61K35/12(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 大連理工大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 李 麗;夏元化;安利佳 |
| 地址 | 116024遼寧省大連市甘井子區(qū)凌工路2號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 大連八方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 衛(wèi)茂才 |
| 國省代碼 | 遼寧;21 |
| 主權(quán)項 | 一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，步驟是： (1)外周血單個核細(xì)胞的制備： 取腫瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理鹽水對倍稀釋后，用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，分離所用離心機之轉(zhuǎn)頭為水平轉(zhuǎn)頭，離心速度為2000rpm，離心20分鐘，然后用Hanks平衡液洗滌2-3次再進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)，最后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度成3-5×10-6/ml的細(xì)胞懸液。 (2)外周血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離： 將前述細(xì)胞懸液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱溫育2-3小時，然后用移液管輕輕沖洗細(xì)胞，將非黏附PBL懸液收集在50ml離心管中，田孔板留下的粘附細(xì)胞作誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞用。 (3)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴增： 在上述外周血淋巴細(xì)胞懸液中添加重組人干擾素，終濃度為1000單位/毫升，然后移入表面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，每瓶裝量20毫升，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中溫育24小時，然后添加CD3單抗、白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2，終濃度分別為50納克/毫升、100微克/毫升和800單位/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)，然后用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)解細(xì)胞濃度為2×10-6/毫升，分配到75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20毫升，進(jìn)行擴大培養(yǎng)；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液含完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白介素-1和白介素-2。此后，每瓶48-72小時按上述相同條件擴大培養(yǎng)一次。培養(yǎng)至第8天收集細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞待用。 (4)樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴增 在前述留有粘附細(xì)胞的6孔板中，每孔加入樹突細(xì)胞培養(yǎng)液3毫升。樹突細(xì)胞培養(yǎng)液為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素-4，終濃度分別是1000單位/毫升和500單位/毫升。置于6孔板與37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后在各孔中加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液為完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2。再加入寡核苷酸2006，終濃度3微摩爾/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)，至第5天，加入腫瘤壞死因子，終濃度為100單位/毫升。培養(yǎng)至第8天，用移液管沖洗和收集非粘附和半粘附樹突細(xì)胞待用。 (5)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)制備寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞群。培養(yǎng)液為完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2。 將經(jīng)過寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，分別計數(shù)，離心棄上清后，分別用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為6×10-5/ml和2×10-5/ml。等體積混合后移入75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，置37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔48-72小時按以上細(xì)胞密度分瓶擴大培養(yǎng)一次，培養(yǎng)至2-3周單次或分次回輸體內(nèi)。 |
| 摘要 | 一種高效免疫活性細(xì)胞群制備及用于抗腫瘤的方法屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。是利用寡核苷酸及細(xì)胞因子誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞，用細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞，然后將樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞按一定比例混合培養(yǎng)，得到一種新的免疫效應(yīng)細(xì)胞群寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞群。這種細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞細(xì)胞和樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫細(xì)胞群比較，增殖活性更強，細(xì)胞毒活性遠(yuǎn)高于細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞。寡核苷酸能夠人工合成，對喪失手術(shù)時機以及難以得到腫瘤抗原的病人同樣可以誘導(dǎo)和擴增出遠(yuǎn)高于細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的抗癌活性的免疫細(xì)胞群。適用于自體瘤治療、化療和放療的輔助治療。 |
| 國際公布 |
