蓖麻毒蛋白

    1.抗腫瘤作用
蓖麻毒蛋白對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細胞株和變異細胞株均十分敏感,0.02～0.3mg/ml可以抑制淋巴腺瘤SI、BW5147、MBC2、EL2、骨髓瘤P3、C1、RBS5、S117、S194、J588、MOPC315/P和骨髓樣白血病C1498的生長。
蓖麻毒蛋白對小鼠艾氏腹水癌、腹水肝癌、宮頸癌U14、肉瘤S180及白血病等動物移植性腫瘤均有一定治療作用。于接種后1,3d腹腔注射7.5mg/kg,能夠完全抑制艾氏腹水癌細胞生長,使小鼠生存時間延長。1次腹腔注射蓖麻毒蛋白25mg/kg,48小時后可使癌細胞減少90%;96h后幾乎所有的癌細胞形態(tài)發(fā)生如下改變:細胞膨脹,核心出現(xiàn)空泡及有絲分裂停止,胞漿暗染,周圍亦出現(xiàn)不規(guī)則的空泡等。
蓖麻毒蛋白可以強烈抑制各種癌細胞的蛋白質(zhì)合成,中等強度抑制DNA合成,而對RNA合成的抑制輕微。二氫蓖麻毒蛋白對家兔lysate的無細胞系統(tǒng)(cell-free system)蛋白質(zhì)合成有強烈的抑制作用,證明了它不是影響癌細胞的糖代謝或氨基酸的攝取,而是強烈地抑制真核生物核蛋白體的蛋白質(zhì)合成。
蓖麻毒蛋白具有二個肽鏈,由S-S鏈相聯(lián)。發(fā)生作用前有一個裂解過程,裂解后釋放出A鏈和B鏈,A鏈稱之為效應(yīng)鏈(effectomer):B鏈稱之為結(jié)合鏈(haptomer)。B 鏈可以與細胞表面的碳水化合物受體結(jié)合,反游離的A鏈或者整個毒蛋白分子通過質(zhì)膜帶入胞漿,與核蛋白體60-S亞基發(fā)生作用,抑制氨基酰t-RNA與核蛋白體的酰結(jié)合,使核酸的延伸因子減少,從而使核酸失活,抑制蛋白質(zhì)合成,并導(dǎo)致細胞死亡。
具有針對B細胞類Ia抗原特異反應(yīng)性Mab-737蓖麻毒蛋白通過二硫鍵連接成免疫毒素蓖麻毒蛋白-737 (ricin-737)。體外0.1M 乳糖存在時,此免疫毒素對含B細胞抗原的Burkitt氏淋巴瘤細胞系Raji細胞表現(xiàn)出選擇性地強力殺傷,半數(shù)殺傷濃度IC50為5×10\-1M。同樣條件,以不含靶抗原的對照細胞K562沒有顯著殺傷,IC50 為5×10\-8M,毒性比前者低500倍。游離毒蛋白IC50 為5×10\-8M,比免疫毒素毒性低1000倍。動力學(xué)研究表明,免疫毒素作用1h就可抑制靶細胞的增殖,并隨處理時間延長,殺傷更趨顯著。 結(jié)果提示,免疫毒素ricin-737具有強烈的選擇性殺傷細胞的能力,可成為腫瘤治療的候選藥物。
采用[3H]-亮氨酸摻入及噻唑藍活細胞兩種方法觀察了胃癌單克隆抗體一蓖麻毒蛋白A鏈對人胃癌細胞株KATO Ⅲ(靶細胞)及正常人胚肺細胞SL7(非靶細胞)經(jīng)24h反應(yīng)后的殺傷情況。結(jié)果表明交聯(lián)物對腫瘤靶細胞顯示選擇性殺傷作用,在1×10\-9M水平對靶細胞蛋白質(zhì)合成抑制率達71%,對非靶細胞無抑制作用。說明McAb對蓖麻毒蛋白A鏈具有較好的導(dǎo)向能力。
另據(jù)報道B鏈半乳糖結(jié)合位點封閉的蓖麻毒蛋白-胃癌單克隆抗體MGb2結(jié)合物的制備及其細胞毒特征。首先將引入碘乙酰基團的毒素與引入硫基的抗體反應(yīng),得到的結(jié)合物通過瓊脂糖親和層析柱除去仍保留半乳糖結(jié)合能力的部分。細胞毒性試驗結(jié)果表明,結(jié)合物對腫瘤靶細胞具有較強的選擇性殺傷作用,在1.0×10\-1 1mol/L水平,對人胃癌細胞KATO Ⅲ 的殺傷率為46%,優(yōu)于MGb2-蓖麻毒蛋白A鏈結(jié)合物(12%),而對非靶細胞作用很弱,在1.0×10\-9mol/L水平對正常人胚肺細胞SL7殺傷率僅為42%,無需半乳糖拮抗。
免疫毒素(IT)是較為理想的一類腫瘤定向治療藥物。通過實驗將多克隆抗甲胎蛋白抗體(aAFP)與蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)偶聯(lián)成免疫毒素aAEp-RTA,并采用熒光染色、流式細胞儀技術(shù)測定該免疫毒素的體外細胞毒效應(yīng),初步證實了山羊抗大鼠aAFP-RTA免疫毒素對大鼠腹水型肝癌AH68細胞具有較強的特異性體外細胞毒效應(yīng),用熒光染色、流式細胞儀法測定抗腫瘤藥物的體外細胞毒作用具有快速、準確及重復(fù)性好等優(yōu)點。
另據(jù)報道,從汀西野生蓖麻籽中提取了兩種植物毒蛋白ricin Ⅰ、ricin Ⅱ,其分子量分別為65,67KD。用制備的抗大腸癌單克隆抗體Hb3作為導(dǎo)向載體,與蓖麻毒蛋白A肽鏈交聯(lián),制備雜交分子Hb3-RTA。初步細胞毒試驗顯示,交聯(lián)物Hb3-RTA對大腸癌細胞HRT-18具有較強殺傷作用,而對正常人淋巴細胞殺傷作用較小。
將蓖麻毒蛋白和阿霉素偶聯(lián)到一個抗人膀胱癌單克隆抗體分子上,構(gòu)建了第一個具有“雙彈頭”的抗腫瘤導(dǎo)向藥物。這個雙彈頭免疫毒素在0.1M半乳糖存在下,對無關(guān)癌細胞無殺傷作用,但對人膀胱癌細胞BIU-87及E-J細胞的殺傷作用比McAb-Ricin強10倍,比McAb-Adriamycin強約30 000倍。該藥中Ricin  B鏈具有細胞結(jié)合活性,因此不適于體內(nèi)應(yīng)用。但在體外,用0.1M的半乳糖封閉其B鏈的細胞結(jié)合點后,具有高度特異的強靶細胞殺傷活性。
2.熱原作用
蓖麻毒蛋白是一個很強的熱原物質(zhì)。它對各種哺乳類動物和人類都具有十分強的致熱作用,0,05～0.2mg/kg就可以產(chǎn)生熱原反應(yīng),比其他任何熱原都強而持久,潛伏期也長。大鼠皮下注射蓖麻毒蛋白20mg/kg,3.5h后體溫開始升高,持續(xù)時間超過6h。反復(fù)注射可以產(chǎn)生耐受性,但與細菌類熱原物質(zhì)無交叉耐受性。經(jīng)所造成的熱原反應(yīng)可用阿司匹林、非那西汀等解勢。故認為它可作為解熱實驗的工具藥。
3.免疫反應(yīng)
蓖麻毒蛋白具有很強的抗原性,以各種途徑進入人體或各種哺乳動物體內(nèi)可產(chǎn)生抗體和過敏反應(yīng),種植蓖麻的農(nóng)民血液中也存在這種抗體,稱之為蓖麻毒蛋白抗體,十分穩(wěn)定,除此之外,還可以使體內(nèi)非特異抗體升高。此過程中血漿組分發(fā)生變化,由于肝毒的作用,白蛋白水平下降,隨著肝再生白蛋白水平逐漸上升,α-球蛋白上升,而β-球蛋白下降。說明蓖麻毒蛋白特異地破壞蛋白質(zhì)的合成可以受抗體的作用而減弱;熱原反應(yīng)也可以被抑制。由于蓖麻毒蛋白能產(chǎn)生細胞毒作用,因此,它能抑制巨噬細胞等參與免疫功能的細胞。
識別普通型急性淋巴細胞白血病抗原(CAL-LA)的單克隆抗體共價連接到完整的蓖麻毒蛋白上,間接免疫熒光顯示此免疫毒素(79:Ricin)能與Nalm-1靶細胞結(jié)合�？寺』�試驗表明:半乳糖存在時,10\-9～10\-8M 79:Ricin能殺死99.9%Nalm-1細胞。正常骨髓細胞的存在并不影響它清除靶細胞的效果。79:Ricin免疫毒素對骨髓造血干細胞毒性不大。
以BALB/C小鼠經(jīng)綿條紅細胞(SRBC)免疫后,初次反應(yīng)產(chǎn)生抗體所導(dǎo)致溶解SR-BC后的光密度值指標,測定了蓖麻毒蛋白對小鼠初次體液免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果表明,蓖麻毒蛋白對小鼠的體液免疫功能有明顯的抑制作用,光密度值和凝血滴度分別下降到正常小鼠相應(yīng)數(shù)值的1/7和1/9左右。
4.對心血管和呼吸系統(tǒng)的作用
1次靜注蓖麻毒蛋白3.2mg/kg是使麻醉免產(chǎn)生心、肝、腎中毒反應(yīng)的臨界劑量,小于此量時對心血管及呼吸系統(tǒng)無明顯影響。而麻醉貓注射250～500mg/kg時,血壓立即上升,脈搏、呼吸加快和潮氣量增加。當(dāng)注射劑量增至30mg/kg時,血壓降至零,心跳停止于舒張期,出現(xiàn)潮式呼吸而死亡;心電圖出現(xiàn)R-R間隔延長,P波消失,T波倒置等現(xiàn)象。麻醉貓靜注蓖麻毒蛋白250～500mg/kg可以輕微地對抗β-受體興奮劑異丙腎上腺素。朱注射黎蘆堿25μg/kg,然后注射蓖麻毒蛋白可以使腎上腺素、去甲腎上腺素、乙酰膽堿、升壓素和組織胺的全部藥理學(xué)作用減弱。蓖麻毒蛋白還能降低黎蘆堿和尼古丁的Bezdd-Jarish反射作用。
5.其他作用
蓖麻毒蛋白可以影響體外培養(yǎng)的各類白細胞的呼吸作用。0.3～3.3mg/ml可降低單核細胞的耗氧量,增加淋細胞的耗氧量;16.6～33.2mg/ml可以降低淋巴細胞的耗氧量,增加嗜中性粒細胞的耗氧量;當(dāng)濃度增至66.6mg/ml時,嗜中性粒細胞的呼吸亦受抑制。
6.體內(nèi)過程
蓖麻毒蛋白在體內(nèi)不易被各種酶水解,故維持較久,而一經(jīng)水解就很快排出。小鼠腹腔和靜脈注射125I一蓖麻毒蛋白后,5h內(nèi)在各組織和器官內(nèi)均保持較高的濃度,最高為脾,依次為腎、心、肝和胸腺,然后迅速下降,經(jīng)10～12h肝臟中消失,其他器官組織經(jīng)10～30h消失。主要由尿排出,排泄量在5～7h達高峰。