醫(yī)學(xué)論文范文:假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高效介導(dǎo)兔平滑肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染

2.2 滴度檢測(cè)結(jié)果

每毫升含重組病毒MuLV顆粒上清液的滴度為5～6.2×105集落形成單位(CFU)，每毫升含重組病毒MuLV/VSV�睪顆粒上清液的滴度為6～7.8×106CFU。皰疹性口炎病毒G糖蛋白修飾的MuLV/VSV�睪轉(zhuǎn)染293T/17細(xì)胞，比單用MuLV所生產(chǎn)病毒的滴度有明顯提高(P<0.05)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。

2.3 假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)SMC鑒定

轉(zhuǎn)導(dǎo)后SMC行X�瞘al染色。方法：吸去細(xì)胞上清，5g/L Glutaradehyd固定細(xì)胞后，PBS清洗3遍后染色。X�瞘al染液：1g/L X�睪al (Gibco BRL)，2mmol/L MgCl2，5mmol/L K3Fe(CN)6和5mmol/L K4Fe(CN)6的PBS液，37℃過(guò)夜后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)高倍視野下(200×)藍(lán)染細(xì)胞與總細(xì)胞的比率(圖2)。

2.4 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的比較

分別將假型逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV/VSV�睪及鼠白血病病毒MuLV轉(zhuǎn)導(dǎo)兔平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MuLV/VSV�睪的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯高于MuLV。MuLV/VSV�睪的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為(92±12)%，MuLV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為(24±5)%，二者差異比較有顯著性(P<0.01)。

3 討論

平滑肌細(xì)胞是血管壁的主要細(xì)胞成分之一，血管平滑肌細(xì)胞增生是血管性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化和移植血管再狹窄的重要原因。將相關(guān)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到平滑肌細(xì)胞中抑制平滑肌細(xì)胞增生可以達(dá)到治療血管性疾病的目的。

平滑肌細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞具有很多獨(dú)特的優(yōu)越性如易獲取和體外擴(kuò)增，易受外源基因的轉(zhuǎn)染并能穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，致瘤性低和相對(duì)其他細(xì)胞安全等[8]。

載體的選擇直接決定了基因表達(dá)的有效性、表達(dá)持續(xù)時(shí)間以及轉(zhuǎn)染的安全性。腺病毒載體作為一種常用的載體轉(zhuǎn)染效率較高，但由于被轉(zhuǎn)染的基因沒(méi)有融合到染色體，基因的表達(dá)是短暫的。而MuLV衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染基因并長(zhǎng)期表達(dá)。但逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因轉(zhuǎn)染效率較低[7]，需要通過(guò)篩選來(lái)殺死未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。為了篩選，需要在基因結(jié)構(gòu)中加入抗性基因和相關(guān)的啟動(dòng)子。例如，新霉素類G418，來(lái)殺死未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。只有轉(zhuǎn)染了目的基因和抗性基因的細(xì)胞才能存活下來(lái)。如果載體轉(zhuǎn)染基因的效率接近100%，篩選的過(guò)程就可以省略。省略篩選既可以簡(jiǎn)化基因的結(jié)構(gòu)又可以減少篩選的時(shí)間和存活細(xì)胞復(fù)制的時(shí)間。提高基因轉(zhuǎn)染效率是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵。VSV�睪/MuLV將報(bào)告基因lacZ轉(zhuǎn)染到平滑肌細(xì)胞的效率達(dá)到90%，幾乎所有的細(xì)胞都被轉(zhuǎn)染，所以可以認(rèn)為篩選已經(jīng)不必要了。假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體VSV�睪/MuLV具有高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[4]，有以下幾種因素：①VSV�睪包膜糖蛋白是單鏈肽，比MuLV更穩(wěn)定，穩(wěn)定的包膜有利于高滴度病毒上清液的產(chǎn)生，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。②可以更多地結(jié)合病毒的受體，以便VSV�睪/MuLV與細(xì)胞結(jié)合。

采用小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞對(duì)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液進(jìn)行滴度測(cè)定，是由于NIH3T3容易在體外培養(yǎng)，具有較長(zhǎng)的壽命，容易被外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，是良好的基因轉(zhuǎn)移靶細(xì)胞。本研究成功的構(gòu)建了假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體VSV�睪/MuLV，用于轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞獲得了較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，說(shuō)明該載體可以用于平滑肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染并進(jìn)一步應(yīng)用于基因治療之中醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。

【參考文獻(xiàn)】

[1]陳勇兵，陳如沖，陳力新. 型假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 [J]. 江蘇醫(yī)藥雜志, 2004, 30(9):644��646.

[2]YU H, ETON D, WANG Y, et al. High efficiency in vitro gene transfer into vascular tissues using a pseudo typed retroviral vector without pseudo transduction [J]. Gene Ther, 1999, 6(11):1876��1883.

[3]SONEOKA Y, CANNON PM, RAMSDALE EF, et al. A transient three plasmid expression system for the production of high titer retroviral vector [J]. Nucleic Acids Res, 1995, 23(4):628��633.

[4]SCHOLL FG, SEN L, DRINKWATER DC, et al. Effects of human tissue plasminogen gene transfer on allograft coronary atherosclerosis [J]. Heart Lung Transplant, 2001, 20(3):322��329.

[5]司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng) [M]. 西安：世界圖書出版西安公司， 2004:71��77.

[6]DARWIN E, THOMAS TT, WANG Y, et al. Genetic engineering of stent grafts with a highly efficient pseudo typed retroviral vector [J]. Journal of Vascular Surgery, 1999, 29(5):863��873.

[7]傅建穎，陳子興，岑建農(nóng). 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)高效的白血病細(xì)胞基因轉(zhuǎn) [J]. 中華腫瘤志, 2001, 20(3):178��183.

[8]曹雪濤，章衛(wèi)平，陳國(guó)友. 腫瘤基因治療的受體細(xì)胞研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)，2005, 28(2):174��175.

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