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3 討論
Claudins 是構(gòu)成細胞緊密連接的一類重要的跨膜蛋白，其表達和定位對于緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的完整性都非常重要。Claudin-6 是 claudins 家族成員之一。近來的研究表明 claudins 表達改變與上皮來源的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)。在某些特定上皮來源腫瘤中 claudins 表達異常，例如 claudin-1 表達下調(diào)或claudin-3 和-4 上調(diào)能夠增加腫瘤細胞的侵襲性，促進瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化。臨床上，某些claudins 表達異常是判斷侵襲性腫瘤預后的重要指標。因此，確定claudins 在腫瘤發(fā)病中的作用能夠為我們更深入的了解腫瘤發(fā)生及惡變的機制提供幫助。
我們在前期的研究工作中克隆和鑒定了腫瘤抑制相關(guān)基因claudin-6，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染claudin-6真核表達載體的MCF-7細胞單克隆，發(fā)現(xiàn)細胞表達claudin-6后生物學行為發(fā)生了很大改變，比較突出的變化就是細胞生長緩慢并且出現(xiàn)了明顯的死亡，為驗證這種死亡部分是由于細胞凋亡造成的我們對轉(zhuǎn)染前后的細胞進行了凋亡的檢測并比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，claudin-6表達細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。
細胞凋亡是一個非常復雜的生理過程，對于有機體維持穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，凋亡的缺失常常是腫瘤發(fā)生的原因之一。許多因素都可以誘發(fā)細胞凋亡，而不同誘導因素可經(jīng)不同途徑誘導細胞凋亡，同一種誘導因素在不同條件下的作用機制也不盡相同。因此，我們推測 MCF-7 細胞中 claudin-6 表達的缺失導致細胞逃避了凋亡，并且在癌變過程中發(fā)揮了一定的作用。而且，Makoto 等人發(fā)現(xiàn)MCF-7細胞中 claudin-6基因表達沉默使細胞對凋亡誘導劑的敏感性降低。此外該研究組證明抑制 occludin 能導致細胞對致凋亡因素的抵抗性增加以及能逃逸細胞老化程序，因此增強了癌細胞的致癌、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。
目前關(guān)于claudins誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究甚少，因此本研究為探討claudins促瘤細胞凋亡的調(diào)控機理提供了線索。
本文報道了在MCF-7細胞系中，claudin-6表達上調(diào)能明顯促進細胞凋亡，從而達到抑瘤作用。凋亡在防止癌癥的發(fā)生和維持阻止穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)凋亡活性的缺失促進了腫瘤的發(fā)展。因此，更好理解claudin-6表達缺失誘導的細胞凋亡在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。 此外，claudin-6的表達也降低了癌細胞的惡性表型，如侵襲和遷移活性，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。
接著我們對claudin-6誘導細胞凋亡的信號通路進行了檢測。至今，關(guān)于claudins參與的信號通路研究甚少，但是發(fā)現(xiàn)其與一些信號通路有關(guān)。如Taddei等人發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在鼠胚胎干細胞中claudin-5表達上調(diào)時PI(3)K–Akt pathway途經(jīng)被激活。Kun Zhang等人發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞系T47D中claudin-1表達下調(diào)能夠激活Erk1/2途經(jīng)，從而導致細胞的運動性增加。此外，Oshima等人發(fā)現(xiàn)應用阿司匹林處理人類胃癌細胞系MKN28能通過claudin-7激活p38 MAPK途徑，降低單層培養(yǎng)細胞的跨上皮電阻，提高跨上皮的滲透性。因此，我們檢測了細胞在轉(zhuǎn)染claudin-6前后上述通路的活化狀態(tài)， 同時應用各通路抑制劑進一步確定上述通路在claudin-6誘導凋亡中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比p38 MAPK途徑在claudin-6表達細胞中處于高度活性狀態(tài)，而被檢的其它信號蛋白磷酸化Erk1/2和Akt在各組間沒有明顯差別。隨后我們應用通路特異性抑制劑進一步驗證了假設(shè)。結(jié)果表明應用通路特異性抑制劑后磷酸化的p38明顯減少，而其它被檢的信號蛋白改變不明顯。p38 MAPK途徑主要參與細胞應激反應和炎癥反應，還參與細胞增殖、凋亡和分化。近來研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK在細胞凋亡過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)不同細胞在受到不同刺激影響時，p38 MAPK所扮演的角色是完全不同的。一些研究者發(fā)現(xiàn)p38 MAPK途徑活化通過介導caspase激活或p53磷酸化誘導凋亡p38 MAPK參與細胞凋亡過程，與誘導bax轉(zhuǎn)位；介導caspase的活化；p53磷酸化及增強TNF的表達介導的凋亡有關(guān)。但也有研究表明，p38MAPK信號通路也通過抑制前凋亡信號的產(chǎn)生，參與介導細胞存活信號通路而抑制細胞凋亡。在本研究中，p38在claudin-6表達的MCF-7細胞中明顯處于活化狀態(tài)，加入抑制劑后可明顯抑制其活化。因此，我們假設(shè)應用通路特異性抑制劑也能影響到claudin-6介導的細胞凋亡和轉(zhuǎn)移表型。為驗證這一假設(shè)，我們檢測了應用p38通路特異性抑制劑前后細胞的凋亡、侵襲和遷移活性。結(jié)果表明，與對照組相比，claudin-6表達克隆C2的細胞凋亡明顯降低（Fig.3A right，C2)，克隆C1的細胞凋亡率也呈現(xiàn)出降低的趨勢。我們的結(jié)果表明，表達claudin-6的MCF-7細胞凋亡部分是由p38 MAPK途徑介導的。此外，我們發(fā)現(xiàn)當p38途徑受到抑制時，claudin-6表達的MCF-7的侵襲和遷移活性增高。眾所周知侵襲和遷移活性能夠反映腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，我們的結(jié)果表明claudin-6可能通過p38 MAPK信號通路降低了細胞侵襲活性。至今，關(guān)于claudins參與p38 MAPK信號途徑的研究少有報道。因此，本研究為claudins參與的信號通路增加了新的觀點。醫(yī).學.全.在.線gydjdsj.org.cn
總之，我們的結(jié)果表明在某種特定腫瘤中claudin-6是一個重要的腫瘤抑制基因。但是，我們目前的研究我們并未弄清claudin-6是如何通過p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)細胞表型的。下一步的研究我們將著眼于claudin-6參與腫瘤抑制的精確分子機制。在某些特定腫瘤中恢復內(nèi)源性claudin-6的表達可能作為誘導細胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要治療手段。
