實驗六 精斑檢驗
一、精斑預(yù)試驗
【目的要求】
熟悉掌握紫外線照射法、酸性磷酸酶檢測法的原理及方法；了解精斑預(yù)試驗的其它常用方法。
【實驗內(nèi)容】
（一) 儀器設(shè)備及試劑
1. 儀器設(shè)備
紫外燈、水浴鍋、溫箱、燒杯、試管、試管架、毛細吸管、顯微鏡、載玻片、蓋玻片。
2. 試劑
緩沖液、顯色劑、碘化鉀試劑、0.01%淀粉溶液、碘液。
（二)實驗方法
1. 紫外線檢查
將可疑精斑檢材置于紫外線燈下檢查，精斑在紫外線下發(fā)銀白色熒光，周圍較深，帶紫藍色邊緣，查見后，將斑痕范圍用蠟筆劃出。
2. 酸性磷酸酶檢出法
（1) 剪取可疑精斑檢材少許（約0.1cm2大小)置于試管內(nèi)，加緩沖液3-4滴。
（2) 將試管放入37℃溫箱（或水浴鍋)內(nèi)約5-7分鐘。
（3) 加顯色劑3-4滴觀察結(jié)果。
（4) 結(jié)果判定：陽性，淺紅色至深色或紅色沉醫(yī)學考研網(wǎng)淀；陰性：橙黃色。
3. 碘化鉀結(jié)晶試驗
剪取可疑精斑檢材少許置玻片上，加1滴蒸餾水浸軟，用針頭將基質(zhì)纖維分離，加蓋玻片，從蓋玻片邊緣滴加試劑1-2滴；鏡檢。
結(jié)果：初見褐色顆粒，逐漸形成褐色或褐紅色針狀或菱形結(jié)晶，有時可檢出精子。
二、精斑的精子檢出法
【目的要求】
熟悉掌握精子檢出法的原理及方法。
【實驗內(nèi)容】
（一)儀器設(shè)備及試劑
1. 儀器設(shè)備
試管、試管架、剪刀、玻棒、載玻片、蓋玻片、顯微鏡
2. 試劑
生理鹽水、酒精（無水、90%、80%、50%)、蘇木素染液、鹽酸酒精、伊紅溶液、二甲苯、中性樹膠。
酸性復(fù)紅亞甲蘭染液配制：
1%酸性品紅 1ml
1%亞甲蘭 1ml
1%鹽酸 40ml
酸性品紅靛藍胭脂紅染液配制：
第一液：溶解5g硫酸鋁于100ml沸蒸餾水中，加0.1g酸性品紅，攪拌溶解。
第二液：將0.5g靛藍胭脂紅溶于100ml蒸餾水中，加1ml鹽酸，1ml甘油混勻。
（二) 實驗方法
剪取斑跡中央部分（精子多集中在斑跡的中央)，約1cm2，剪碎置試管內(nèi)，滴加生理鹽水，浸透檢材后再多加5-6滴，置室溫2h，4℃冰箱12-24h，用玻棒擠壓檢材，去除粗的纖維，離心20min，上清液供作抗人精液沉淀反應(yīng)及測定血型用。沉渣則涂于玻片上，用甲醇固定1min，自然干燥后染色鏡檢，查精子。
1． 蘇木素—伊紅染色
﹙1﹚ 將涂片浸于95%酒精中2migydjdsj.org.cn/yishi/n；
﹙2﹚ 80%酒精2 min；
﹙3﹚ 50%酒精2 min；
﹙4﹚ 水洗2 min；
﹙5﹚ 蘇木素染液5-10 min；
﹙6﹚ 玻片在水中漂洗數(shù)次；
﹙7﹚ 1%鹽酸酒精分化數(shù)sec；
﹙8﹚ 流水沖洗20-30 min；
﹙9﹚ 伊紅染色液1.5 min；
﹙10﹚ 水中漂洗數(shù)次；
﹙11﹚ 投入50%酒精中后即取出；
﹙12﹚ 95%酒精，10 sec；
﹙13﹚ 無水酒精5-10 sec；
﹙14﹚ 二甲苯1-2 min；
﹙15﹚ 中性樹膠封固；
﹙16﹚ 鏡檢，精子細胞核染色體，其他部分染紅色。
2． 酸性復(fù)紅亞甲蘭染色
涂片干燥后，滴加酸性復(fù)紅亞甲蘭染液染5-10，用自來水反復(fù)沖洗，用濾紙吸去水分，鏡檢。精子頭部的后半部﹙即核﹚染成蘭色，前半部不著色或淺染，體及尾部染成紅色。只要見到一個典型的精子，即能確認為精斑。陳舊精斑，處理過分粗暴，往往只見精子頭部。如果見到幾個典型的精子頭部也可確證精斑。
3． 酸性品紅靛藍胭脂紅染色
涂片在酸性品紅靛藍胭脂紅染液的第一液中染色30 sec。用1%HCl洗去第一液。再用第二染色15 sec。用95%乙醇沖洗，干后用樹膠封閉，鏡檢。精子頭部染深紫紅色，頸段呈白色、尾部主段和末段染成紫蘭色。
