P360  圖20-1RNA聚合酶的活性中心

核心酶覆蓋60bp的DNA區(qū)域，其中解鏈部分17bp左右，RNA-DNA雜合鏈約12bp。
純的RNA聚合酶，在離體條件下可轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA，但在體內(nèi)，DNA的兩條鏈中只有一條可用于轉(zhuǎn)錄，這可能是由于RNA聚合酶在分離時(shí)丟失了σ亞基引起的。
解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的內(nèi)在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活體狀況中，可能還有其它酶活性來(lái)幫助調(diào)整DNA的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)。
37℃時(shí)，RNA聚合酶的聚合速度可達(dá)40~100個(gè)核苷酸/秒
2、 真核生物RNA聚合酶
真核生物的轉(zhuǎn)錄機(jī)制要復(fù)雜得多，有三種細(xì)胞核內(nèi)的RNA聚合酶：RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄rRNA，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄mRNA，RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄tRNA和其它小分子RNA。這三種RNA聚合酶分子量都在50萬(wàn)左右，亞基數(shù)分別為6-15。

P362  表20-3    真核生物RNA聚合酶的分類、分布及各自的功能

動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)等不同來(lái)源的細(xì)胞，RNApolⅡ的活性都可被低濃度的α-鵝膏蕈堿抑制，而RNApolⅠ不受抑制。
動(dòng)物RNApolⅢ受高濃度的α-鵝膏蕈堿抑制，而酵母、昆蟲(chóng)的RNApolⅢ不受抑制。
除了細(xì)胞核RNA聚合酶外，還分離到線粒體和葉綠體RNA聚合酶，它們的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能轉(zhuǎn)錄所有種類的RNA，類似于細(xì)菌RNA聚合酶。
3、 噬菌體T3和T7編碼的RNA聚合酶
僅為一條分子量11KD的多肽鏈，這些聚合酶只需要識(shí)別噬菌體DNA的少數(shù)啟動(dòng)子，并無(wú)選擇地與其作用，37℃時(shí)的聚合速度200nt/秒。
二、 RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程（E.coli）
P361  圖20-2
1、 起始
RNA聚合酶結(jié)合到DNA雙鏈的特定部位，局部解開(kāi)雙螺旋，第一個(gè)核苷酸摻入轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，從此開(kāi)始RNA鏈的延伸。
在新合成的RNA鏈的5’末端，通常為帶有三個(gè)磷酸基團(tuán)的鳥(niǎo)苷或腺苷（pppG或pppA），即合成的第一個(gè)底物是GTP或ATP。
起始過(guò)程中，σ因子起關(guān)鍵作用，它能使聚合酶迅速地與DNA的啟動(dòng)子結(jié)合，σ亞基與β’結(jié)合時(shí)，β’亞基的構(gòu)象有利于核心酶與啟動(dòng)子緊密結(jié)合，。
正鏈：與mRNA序列相同的兩、鏈。
負(fù)鏈：模板鏈。
轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是+1，上游是-1。
2、 延長(zhǎng)
轉(zhuǎn)錄起始后，σ亞基釋放，離開(kāi)核心酶，使核心酶的β’亞基構(gòu)象變化，與DNA模板親和力下降，在DNA上移動(dòng)速度加快，使RNA鏈不斷延長(zhǎng)。
轉(zhuǎn)錄起始后，σ亞基便從全酶中解離出來(lái)，然后nusA亞基結(jié)合到核心酶上，由nusA亞基識(shí)別序列序列。
3、 終止
RNA聚合酶到達(dá)轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)時(shí)，在終止輔助因子的幫助下，聚合反應(yīng)停止，RNA鏈和聚合酶脫離DNA模板鏈，nusA又被σ亞基所取代。。
由此形成RNA聚合酶起始復(fù)合物與終止復(fù)合物兩種形式的循環(huán)
三、 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子
啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA序列。
轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常需要一些輔助因子（蛋白質(zhì)）參與作用，此類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。
足跡法和DNA測(cè)序法確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。
P363
（一） 原核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能
分析比較上百種啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)不同的啟動(dòng)子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。
（1）、 -10序列（Pribnow框）
在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游大約-10處，有一個(gè)6bp的保守序列TATAAT，稱Pribnow框。此段序列出現(xiàn)在-4到-13bp之間，每個(gè)位點(diǎn)的保守性在45%-100%。
頻度： T89 A89 T50 A65 A65 T100
據(jù)預(yù)測(cè)，Pribnow框中，一開(kāi)始的TA和第6位最保守的T在結(jié)合RNA聚合酶時(shí)起十分重要的作用。
目前認(rèn)為，Pribnow框決定轉(zhuǎn)錄方向。酶在此部位與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，Pribnow框中DNA序列在轉(zhuǎn)錄方向上解開(kāi)，形成開(kāi)放型起始結(jié)構(gòu)，它是RNA聚合酶牢固的結(jié)合位點(diǎn)，是啟動(dòng)子的關(guān)鍵部位。
RNA聚合酶的結(jié)合，誘導(dǎo)富含AT的Pribnow框的雙鏈解開(kāi)，然后進(jìn)一步擴(kuò)大成17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的泡狀物，在泡狀物中RNA聚合酶從模板鏈開(kāi)始轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物。
（2）、 -35序列（Sexfama box）（識(shí)別區(qū)域）
只含-10序列的DNA不能轉(zhuǎn)錄，在-10序列上游還有一個(gè)保守序列，其中心約在-35位置，稱為-35序列，此序列為RNA酶的識(shí)別區(qū)域。
各堿基出現(xiàn)頻率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。
-35序列的功能：它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始識(shí)別位點(diǎn)。因此，-35序列對(duì)RNA聚合酶全酶有很高的親和性。-35序列的核苷酸結(jié)構(gòu)，在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度，RNA聚合酶易識(shí)別強(qiáng)的啟動(dòng)子。
-35序列提供RNA聚合酶識(shí)別信號(hào)，
-10序列有助于DNA局部雙鏈解開(kāi)，
啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性決定了轉(zhuǎn)錄的方向。
P364  圖20-4  原核型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)
（二） 真核啟動(dòng)子
真核基因的轉(zhuǎn)錄十分復(fù)雜，對(duì)啟動(dòng)子的分析要比原核基因的困難得多。
真核生物有三種RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分別轉(zhuǎn)錄rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA，這三類聚合酶的啟動(dòng)子各有其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
1、 RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子
RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子有三個(gè)保守區(qū)：
（1）、 TATA框（Hogness框）
中心在-25至-30，長(zhǎng)度7bp左右。
堿基頻率：T82 A97 A85 A63 （T37 ）A83 A50（T37 ）（全為A-T，少數(shù)含有一個(gè)G-C對(duì)）。
此序列功能：使DNA雙鏈解開(kāi)，并決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)位置，失去TATA框，轉(zhuǎn)錄將可能在許多位點(diǎn)上開(kāi)始。
TATA框的改變或缺失，直接影響DNA與酶的結(jié)合程度，會(huì)使轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)偏移，因此，TATA是絕大多數(shù)真核基因正確表達(dá)所必需的。
由于RNA聚合酶分子有相對(duì)固定的空間結(jié)構(gòu)，同此框的結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)催化位點(diǎn)的距離，決定了起始位點(diǎn)的正確選擇。啟動(dòng)子特定序列和酶的正確結(jié)構(gòu)，這兩者把酶置于一種正確的構(gòu)象中，決定了識(shí)別的正確性和轉(zhuǎn)錄起始的正確性。
（2）、 CAAT框
中心在-75處，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT
功能：與RNA聚合酶結(jié)合。
（3）、 GC框
在CAAT框上游，序列GGGCGG，與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。
CAAT和GC框均為上游序列，對(duì)轉(zhuǎn)錄的起始頻率有較大影響。
2、 RNApolⅢ的啟動(dòng)子
RNApolⅢ的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部。
P365圖20-5   由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的三個(gè)基因的啟動(dòng)子
四、 終止子和終止因子
終止子：提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的一段DNA序列。
終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止子的蛋白質(zhì)輔助因子。
有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶越過(guò)終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，稱為通讀，這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子。
終止子位于已轉(zhuǎn)錄的序列中，DNA的終止子可被RNA聚合酶本身或其輔助因子識(shí)別。
P366圖20-6
1、 大腸桿菌中的兩類終止子
P366圖20-6
所有原核生物的終止子在終止點(diǎn)之前都有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)，它轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA可以形成一個(gè)頸環(huán)式的發(fā)莢結(jié)構(gòu)。
（1）、 不依賴于ρ的終止子（簡(jiǎn)單終止子）
簡(jiǎn)單終止子除具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)外，在終止點(diǎn)前有一寡聚U序列，回文對(duì)稱區(qū)通常有一段富含GC的序列。
寡聚U序列可能提供信號(hào)使RNA聚合酶脫離模板。
（2）、 依賴ρ的終止子
依賴ρ的終止子，必需在ρ因子存在時(shí)，才發(fā)生終止作用。終止點(diǎn)前無(wú)寡聚U序列，回文對(duì)稱區(qū)不富含GC。
ρ因子是55KD的蛋白質(zhì)，可水解三磷酸核苷。
2、 抗終止作用
通讀往往發(fā)生在強(qiáng)啟動(dòng)子、弱終止子的基因上。
抗終止作用常見(jiàn)于某些噬菌體的時(shí)序控制。早期基因于后基因之間以終止子相隔開(kāi)，通過(guò)抗終止作用可以打開(kāi)后基因的表達(dá)。
λ噬菌體前早期（immediate early）基因的產(chǎn)物N蛋白就是一種抗終止因子。它與RNA聚合酶作用使其在左右兩個(gè)終止子處發(fā)生通讀，從而表達(dá)晚早期（delayed early）基因。晚早期基因的產(chǎn)物Q蛋白也是一種抗終止因子，它能使晚早期基因得以表達(dá)。
五、 轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)控制
參閱P367轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)控制、P450基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

基因的表達(dá)是受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制的，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要發(fā)生在起始和終止階段。
時(shí)序調(diào)控：生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、時(shí)間程序。
適應(yīng)調(diào)控：細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境改變。可位于基因的上游或下游區(qū)或內(nèi)含子中。
操縱子：原核生物基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位，包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因及由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物所識(shí)別的控制序列（啟動(dòng)子、操縱基因）。
增強(qiáng)子：真核生物、病毒的基因組內(nèi)，對(duì)轉(zhuǎn)錄起增強(qiáng)作用的一段DNA序列。它具有長(zhǎng)距離效應(yīng)，與方向無(wú)關(guān)，只作用于同一條DNA鏈上的啟動(dòng)子。
轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控取決于調(diào)節(jié)因子（RNA或蛋白質(zhì)）與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子之間的相互作用。
（一） 原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
1、 操縱子模型
調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物可以是負(fù)調(diào)節(jié)物（如阻遏蛋白），也可以是正調(diào)節(jié)物，它們與操縱基因作用，關(guān)閉或打開(kāi)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)
2、 cAMP能促進(jìn)許多原核生物的基因表達(dá)
cAMP可以活化環(huán)腺苷酸受體蛋白（cAMP receptor  protein，CRP），CRP作為一種廣譜性的正調(diào)節(jié)物，結(jié)合于被調(diào)控的啟動(dòng)子上，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。
葡萄糖效應(yīng)：培養(yǎng)基中葡萄糖含量較高時(shí)，細(xì)菌首先利用葡萄糖，阻遏利用其它底物的酶類的合成。
原因：葡萄糖的降解物可以抑制腺苷酸環(huán)化酶的活力，并激活磷酸脂酶，因而降低cAMP的水平，使這些酶的基因不能轉(zhuǎn)錄。
因此，CRP又稱降解物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein,CAP）。受cAMP-CRP調(diào)節(jié)的操縱子（既代謝降解物敏感的操縱子）包括許多負(fù)責(zé)糖類分解代謝的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，如乳糖操縱子，半乳糖操縱子。，阿拉伯糖操縱子等，以及負(fù)責(zé)氨基酸合成代謝的可阻遏的操縱子，如Ile-Val操縱子（iLV）。
調(diào)節(jié)子：受一種一種調(diào)節(jié)蛋白所控制的幾個(gè)操縱子系統(tǒng)，這些操縱子通常都屬于同一個(gè)代謝途徑或與同一種功能有關(guān)。
綜合性調(diào)節(jié)子：一種調(diào)節(jié)蛋白控制幾個(gè)不同代謝途徑的操縱子，如cAMP-CRP對(duì)各種分解代謝和合成代謝的調(diào)控系統(tǒng)。
3、 衰減子的調(diào)控作用
（二） 真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
第二節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后的加工
RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，要經(jīng)過(guò)剪切、修飾、拼接等過(guò)程，才能轉(zhuǎn)變成成熟的RNA分子，此過(guò)程稱RNA轉(zhuǎn)錄后的加工。
（1）、 原核、真核的tRNA、rRNA（穩(wěn)定的RNA）
細(xì)胞內(nèi)的tRNA、rRNA相對(duì)穩(wěn)定，半衰期一般為幾個(gè)小時(shí)。所有的tRNA、rRNA都不是原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)一系列的加工才能成為有活性的分子。
a. 原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’是三磷酸（pppG、pppA），而成熟的tRNA、rRNA ，5’是單磷酸。
b. 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初轉(zhuǎn)錄物小。
c. 所有的tRNA分子，都有原初轉(zhuǎn)錄物所沒(méi)有的稀有堿基（A、G、C、U以外的堿基）。
（2）、 真核的mRNA
單順?lè)醋�，多�?nèi)含子。壽命比原核mRNA的長(zhǎng)。
內(nèi)含子、內(nèi)元（intron）：在原初轉(zhuǎn)錄物中，通過(guò)RNA拼接反應(yīng)而被去除的RNA序列，或基因中與這種序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。
外顯子、外元（exon）：原初轉(zhuǎn)錄物通過(guò)RNA拼接反應(yīng)后，而保留于成熟RNA中的序列，或基因中與成熟RNA對(duì)應(yīng)的DNA序列。
（3）、 原核mRNA
多順?lè)醋�，半衰期只有幾分鐘。這是原核生物重要的調(diào)控機(jī)制，如果一種酶或蛋白質(zhì)不再需要時(shí)，只需簡(jiǎn)單地關(guān)閉其mRNA的合成就行了。

一、 原核生物RNA的加工
在原核生物中，rRNA基因與某些tRNA基因組成混合操縱子，可提高效率、節(jié)省空間（增加有效信息）。其它的tRNA基因也成簇存在，并與編碼蛋白質(zhì)的基因組成操縱子，它們?cè)谛问蕉囗樂(lè)醋愚D(zhuǎn)錄物后，斷裂成為rRNA和tRNA的前體，然后進(jìn)一步加工成熟。
1、 原核rRNA前體的加工（E.coli）
P 370圖20-7    E.coli rRNA前體的加工

E.coli共有三種rRNA
5S rRNA      120b
16S rRNA     1541b
23S rRNA     2904b
rRNA原初轉(zhuǎn)錄物含6300個(gè)核苷酸，約30S。
大腸桿菌有7個(gè)rRNA的轉(zhuǎn)錄單位（操縱子），它們分散在基因組的各處。每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一個(gè)或幾個(gè)tRNA基因所組成。每個(gè)操縱子中tRNA基因的種類、數(shù)量和位置都各不相同。

RNAaseⅢ是一種rRNA、多順?lè)醋觤RNA加工的內(nèi)切酶，識(shí)別特定的RNA雙螺旋區(qū)。
RNAase E也可識(shí)別P5（5SrRNA前體）兩端形成的雙螺旋區(qū)。
2、 原核tRNA前體的加工
  P371圖20-8

E.coli染色體基因組有60個(gè)tRNA基因，即某種a.a.的tRNA基因不止一個(gè)拷貝。
tRNA基因大多成簇存在，或與rRNA基因，或與蛋白質(zhì)基因組成混合轉(zhuǎn)錄單位。
tRNA前體加工步驟
a. 核酸內(nèi)切酶(RNAaseP、RNAaseF)在tRNA兩端切斷。
b. 核酸外切酶(RNAaseD)從3’端逐個(gè)切去附加序列。
c. 在tRNA3’端加上-CCA-OH。tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶
d. 核苷的修飾（修飾酶）：甲基化酶 / S-腺苷蛋氨酸（SAM），假尿苷合成酶。
（1）、 RNAase P
能識(shí)別空間結(jié)構(gòu)，很干凈地切除tRNA前體的5’端。
含有蛋白質(zhì)和RNA（M1 RNA）兩部分。M1 RNA含375nt，在某些條件下，（提高[Mg2+]、或加入胺類），RNAase P的RNA能單獨(dú)地切斷tRNA前體的5’端序列。
（2）、 RNAaseF
不干凈地切除tRNA前體的3’端序列，需要RNAase D進(jìn)一步修剪。
3、 原核mRNA前體的加工
由單順?lè)醋訕?gòu)成mRNA，一般不需加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄，即可直接進(jìn)行翻譯。有些多順?lè)醋訕?gòu)成的mRNA，須由核酸內(nèi)切酶切成較小的mRNA，然后再進(jìn)行翻譯。
例：核糖體大亞基蛋白L10、L7、L12與RNA聚合酶β、β’亞基的基因組成混合操縱子。
它在轉(zhuǎn)錄出多順?lè)醋觤RNA后，由RNAaseⅢ將核糖體蛋白質(zhì)基因與聚合酶亞基基因的mRNA切開(kāi)，然后各自翻譯。
該加工過(guò)程的意義：可對(duì)mRNA的翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)，核糖體蛋白質(zhì)的合成必須適應(yīng)于rRNA的合成水平，而細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶的合成水平則要低得多。兩者切開(kāi)，有利于各自的翻譯調(diào)控。
二、 真核生物RNA的加工
真核rRNA、tRNA前體的加工過(guò)程與原核的很相似，但mRNA的加工過(guò)程與原核的有很大不同。
1、  真核rRNA前體的加工
真核生物核糖體的小亞基含：16-18S rRNA，大亞基含：26-28S r RNA、5S rRNA、5.8S rRNA（特有）。
真核rRNA基因拷貝數(shù)較多，幾十至幾千個(gè)之間。
真核rRNA基因也成簇排列在一起，18S、5.8S、28S rRNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，彼此被間隔區(qū)分開(kāi)，由RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)長(zhǎng)的rRNA前體。5SrRNA基因也成簇排列，間隔區(qū)不被轉(zhuǎn)錄，由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄后經(jīng)適當(dāng)加工。
哺乳動(dòng)物：45SrRNA前體，含18S、5.8S、28S rRNA
果蠅：38SrRNA前體，含18S、5.8S、28S rRNA
酵母：37SrRNA 前體，17S、5.8S、26S rRNA
rRNA在成熟過(guò)程中可被甲基化，位點(diǎn)主要在核糖2’-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，約1-2%的核苷酸被甲基化。醫(yī)學(xué)全在線 gydjdsj.org.cn
真核生物的核仁是rRNA合成、加工和裝配成核糖體的場(chǎng)所，大、小亞基分別組裝后，通過(guò)核孔轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中參與核糖體循環(huán)。
2、 真核tRNA前體的加工
真核tRNA基因的數(shù)目比原核tRNA的要多的多。例如，E.coli有60個(gè)tRNA基因，啤酒酵母250個(gè)，果蠅850個(gè)，爪蟾1150個(gè)，人1300個(gè)。
真核tRNA基因也成簇排列，被間隔區(qū)分開(kāi)，tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄。
真核tRNA前體的剪切、修飾過(guò)程與原核相似。
3、 真核生物mRNA前體的加工
mRNA原初轉(zhuǎn)錄物是分子量很大的前體，在核內(nèi)加工過(guò)程中形成分子大小不等的中間產(chǎn)物，它們被稱為核內(nèi)不均一RNA（hn RNA）。其中，約有25%可轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA。
hnRNA半壽期很短，比細(xì)胞質(zhì)中的mRNA更不穩(wěn)定，一般在幾分鐘至1小時(shí)。而細(xì)胞質(zhì)mRNA的半壽期為1-10小時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞mRNA最長(zhǎng)可達(dá)數(shù)年。
hnRNA轉(zhuǎn)變成mRNA的加工過(guò)程主要包括：
a. 5’末端形成帽子結(jié)構(gòu)
b. 3’末端切斷并加上polyA
c. 剪接除去內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的序列
d. 甲基化
（1）、 5’末端加帽
反應(yīng)步驟P 374

RNA三磷酸酶，mRNA鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA（鳥(niǎo)嘌呤-7）甲基轉(zhuǎn)移酶，mRNA（核苷-2’）甲基轉(zhuǎn)移酶。
由于甲基化的程度不同，有三種類型的帽子：CAP O型，CAP I型，CAP II型。

★5’帽子也出現(xiàn)于hnRNA，說(shuō)明加帽過(guò)程可能在轉(zhuǎn)錄的早期階段或轉(zhuǎn)錄終止前就已完成。
★5’帽子的功能
a. 在翻譯過(guò)程中起信號(hào)識(shí)別作用，協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合，使翻譯從AUG開(kāi)始。
b. 保護(hù)mRNA，避免5’端受核酸外切酶的降解。
（2）、 3’端加polyA
hnRNA鏈由RNAaseⅢ切斷，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP為供體。
加尾信號(hào)：AATAAA、YGTGTGYY（Y為嘧啶）。
高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3’端區(qū)都有一段非常保守的序列AAUAAA，這一序列離多聚腺苷酸加入位點(diǎn)的距離在11-30nt范圍之內(nèi)。
核內(nèi)hnRNA的3’端也有多聚腺苷酸，表明加尾過(guò)程早在核內(nèi)已經(jīng)完成。hnRNA中的poly（A）比mRNA略長(zhǎng)，平均150-200nt。
polyA的功能
a. 防止核酸外切酶對(duì)mRNA信息序列的降解，起緩沖作用。
b. 與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。
3’脫氧腺苷（既冬蟲(chóng)夏草素）是多聚腺苷酸化的特異抑制劑，但它不抑制hnRNA的轉(zhuǎn)錄。
（3）、 mRNA甲基化
某些真核mRNA內(nèi)部有甲基化的位點(diǎn)，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。
三、 RNA的拼接和催化作用（內(nèi)含子的切除）
多數(shù)真核基因是斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)拼接，去除內(nèi)含子，使編碼區(qū)（外顯子）成為連續(xù)序列。
有些內(nèi)含子可以催化自身的拼接（self-splicing）,有些內(nèi)含子需要在有關(guān)酶的作用下才能拼接。
1、 tRNA前體的拼接
酵母tRNA約有400個(gè)基因，有內(nèi)含子的基因約占1/10，內(nèi)含子長(zhǎng)度14-46bp，沒(méi)有保守性。
切除內(nèi)含子的酶識(shí)別的是tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是什么保守序列。
拼接過(guò)程：
第一步切除內(nèi)含子，第二步RNA連接酶將兩個(gè)tRNA半分子連接。
P375圖20-9酵母tRNAPhe及其前體的結(jié)構(gòu)
P376圖20-10酵母和植物tRNA前體的拼接過(guò)程

2、 四膜蟲(chóng)rRNA前體的自我拼接
四膜蟲(chóng)35S rRNA前體，經(jīng)加工可以生成5.8S 、17S和26SrRNA。
某些品系的四膜蟲(chóng)在其26SrRNA基因中有一個(gè)內(nèi)含子，35S rRNA前體需要拼接除去內(nèi)含子。該拼接過(guò)程只需一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子和鳥(niǎo)苷酸(提供3’-OH)，無(wú)需能量和酶。

P377圖20-11四膜蟲(chóng)rRNA的拼接
3、 mRNA前體的拼接
真核生物所有編碼蛋白質(zhì)的核結(jié)構(gòu)基因，其內(nèi)含子的左端均為GT，右端均為AG。此規(guī)律稱GT-AG規(guī)律（對(duì)于mRNA就是GU-AG，此規(guī)律不適合于線粒體、葉綠體的內(nèi)含子，也不適合于tRNA和某些rRNA的核結(jié)構(gòu)基因）

酵母核基因的內(nèi)含子在靠近3’端還有一個(gè)保守序列，與5’端序列互補(bǔ)，稱為TACTAAC box，也與拼接有關(guān)。
真核細(xì)胞內(nèi)存在許多種類的小分子RNA，大小在100-300nt，有些由聚合酶III轉(zhuǎn)錄，有些由聚合酶II轉(zhuǎn)錄。
核內(nèi)小RNA（snRNA）主要存在于核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)小RNA（scRNA）主要存在于細(xì)胞質(zhì)。
重要的snRNA有U系列snRNA，因其尿嘧啶含量高而得名。U系列snRNA通常都與多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖核蛋白顆粒（RNP）。U-snRNA參與hnRNA的拼接過(guò)程。U3-snRNA與rRNA前體的加工有關(guān)，U1、U2、U4、U5、U6可能都與hnRNA的加工有關(guān)。

P378 圖20-12    U1-snRNA的5’端序列與hnRNA內(nèi)含子拼接處的序列互補(bǔ)

P379圖20-13     hnRNA的拼接過(guò)程
真核生物編碼蛋白質(zhì)的核基因的內(nèi)含子屬于II類內(nèi)含子（反式剪接）
四、 RNA的催化功能  P377
1、 I類內(nèi)含子的自我剪接（順式剪接）
I類內(nèi)含子包括四膜蟲(chóng)rRNA的內(nèi)含子，幾種酵母線粒體的內(nèi)含子，噬菌體T4胸苷酸合成酶的內(nèi)含子等。這些內(nèi)含子有較大的同源性，可自我拼接。
1981，Cech（美國(guó)），四膜蟲(chóng)rRNA前體（約6400nt）能自動(dòng)切除413個(gè)nt的內(nèi)含子，然后加工生成5.8S、17S、26S rRNA。
1984，Apirion（美國(guó)），噬菌體T4的RNA可以在沒(méi)有蛋白質(zhì)參與下自我斷裂，由215nt前體鏈切下76nt 。
2、 獨(dú)具催化活性的小分子RNA
1984，Altman，Pace（美國(guó)），細(xì)菌加工tRNA前體的酶—RNAase P中的M1RNA（375nt）在高濃度的Mg2+或胺類存在時(shí)能單獨(dú)切下tRNA前體的5’端。
1，4-α葡聚糖分支酶中的RNA（31nt）也單獨(dú)具有分支酶活力。
真核的U-snRNA催化rRNA前體、hnRNA前體的加工。
第三節(jié) RNA的復(fù)制
有些RNA病毒，進(jìn)入寄主細(xì)胞后，借助復(fù)制酶而進(jìn)行RNA病毒的復(fù)制。
從感染RNA病毒的細(xì)胞中可以分離出RNA復(fù)制酶，這些RNA復(fù)制酶的模板特異性很強(qiáng)，只識(shí)別病毒自身的RNA，它以病毒RNA為模板，合成與模板性質(zhì)相同的RNA。
一、 噬菌體QβRNA的復(fù)制
噬菌體Qβ：直徑20nm，正十二面體，含30%RNA，其余為蛋白質(zhì)，單鏈RNA，4500個(gè)核苷酸，編碼3-4個(gè)蛋白質(zhì)。
結(jié)構(gòu)：5’端——成熟蛋白（A或A2蛋白）——外殼蛋白（或A1蛋白）——復(fù)制酶β亞基——3’端
Qβ復(fù)制酶：αβγδ四個(gè)亞基，只有β是自己編碼，其余三個(gè)亞基來(lái)自寄主細(xì)胞。

P380   表20-4   Qβ復(fù)制酶亞基的性質(zhì)和功能

進(jìn)入E.coli細(xì)胞后，其RNA即為mRNA，可以直接合成與病毒繁殖有關(guān)的蛋白質(zhì)（復(fù)制酶β亞基）。
QβRNA的復(fù)制過(guò)程：
P381  圖20-14噬菌體QβRNA的復(fù)制過(guò)程：
在Qβ特異的復(fù)制酶合成并裝備好后就開(kāi)始病毒RNA的復(fù)制。

QβRNA翻譯和復(fù)制的自我調(diào)節(jié)：
P381圖20-15
QβRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)（尤其是雙螺旋區(qū)的結(jié)構(gòu)）參與翻譯的調(diào)節(jié)控制：
（1） 只有剛復(fù)制的QβRNA，成熟蛋白基因才能翻譯。
（2） 核糖體能直接啟動(dòng)外殼蛋白基因的翻譯
（3） 復(fù)制酶β亞基基因只有在外殼蛋白合成時(shí)雙鏈打開(kāi)才能進(jìn)行翻譯。

QβRNA的翻譯、復(fù)制受寄主細(xì)胞調(diào)節(jié)，以正鏈RNA為模板復(fù)制負(fù)鏈RNA時(shí)，另需寄主細(xì)胞的HFⅠ和HFⅡ因子。而以負(fù)鏈RNA 為模板復(fù)制正鏈RNA時(shí)，不需這兩個(gè)因子，感染后期大量合成的是正鏈RNA。

二、 病毒RNA復(fù)制的主要方式
1、 正鏈RNA病毒（mRNA）：噬菌體Qβ、灰質(zhì)炎病毒等。
進(jìn)入寄主細(xì)胞后，利用寄主的翻譯系統(tǒng)，首先合成復(fù)制酶及有關(guān)的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行病毒RNA的復(fù)制，最后由病毒RNA和蛋白質(zhì)裝配成病毒顆粒。

2、 負(fù)鏈RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：狂犬病毒等
此類病毒帶有復(fù)制酶，侵入后，復(fù)制酶首先合成出正鏈RNA（mRNA），再以正鏈RNA為模板，合成負(fù)鏈RNA及蛋白質(zhì)，然后裝配。
3、 雙鏈RNA病毒（帶有復(fù)制酶）：呼腸孤病毒等
以雙鏈RNA為模板，在復(fù)制酶作用下先轉(zhuǎn)錄正鏈RNA（mRNA），從而翻譯出蛋白質(zhì)，然后合成負(fù)鏈RNA，形成雙鏈RNA，再包裝。
4、 反轉(zhuǎn)錄病毒（含反轉(zhuǎn)錄酶）：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒
正鏈RNA病毒，它們的復(fù)制需要經(jīng)過(guò)DNA前病毒階段。

不同RNA病毒合成mRNA的途徑可以分4類：      P382  圖20-16
第四節(jié) RNA生物合成的抑制劑
某些核酸代謝的拮抗物和抗生素可抑制核苷酸或核酸的合成，因而可以用于抗病毒或抗腫瘤藥物，也可以用于核酸的研究
一、 嘌呤和嘧啶類似物
抑制核苷酸的合成，還能摻入核酸分子中去，形成異常DNA、RNA，影響核酸功能。
主要有：6-巰基嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、5-氟尿嘧啶 、6-氮尿嘧啶
堿基類似物進(jìn)入體內(nèi)后需轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核苷酸，才表現(xiàn)出抑制作用。
二、 DNA模板功能的抑制劑
此類化合物能與DNA結(jié)合，使DNA失去模板功能，從而抑制其復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。
1、 烷化劑
氮芥（二（氯乙基）胺的衍生物）、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺類。它們帶有活性烷基，使DNA烷基化。
烷化位點(diǎn)：鳥(niǎo)嘌呤N7 ，腺嘌呤N1、N3、N7，胞嘧啶N1
烷基化后，堿基易被水解下來(lái)，留下的空隙可干擾DNA復(fù)制或引起錯(cuò)誤堿基摻入。帶有雙功能基團(tuán)的烷化劑，可同時(shí)與DNA兩條鏈結(jié)合，使雙鏈DNA交聯(lián)，從而失去模板功能。
環(huán)磷酰胺：腫瘤細(xì)胞中磷酰胺酶活化，生成活性氮芥。
苯丁酸氮芥：癌細(xì)胞酵解作用強(qiáng)，乳酸多，pH低，苯丁酸氮芥易進(jìn)入。
2、 放線菌素D（對(duì)真核、原核細(xì)胞都起作用）
有抗菌和抗癌作用。
它可與DNA形成非共價(jià)復(fù)合物，使其多肽部分在DNA的“淺溝”上如同阻遏蛋白一樣，抑制DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。
此類機(jī)理的放線菌素還有色霉素A3、橄欖霉素、光神霉素。
3、 嵌入染料
扁平芳香族染料，可插入雙鏈DNA相鄰堿基對(duì)之間。
溴化乙錠插入后，使DNA在復(fù)制時(shí)缺失或增添一個(gè)核苷酸，從而導(dǎo)致移碼突變，并能抑制RNA鏈的起始及質(zhì)粒的復(fù)制。此外還有原黃素、吖啶黃、吖啶橙等。
三、 RNA聚合酶的抑制物
1、 利福霉素
包括其衍生物利福平，特異地抑制細(xì)菌RNA聚合酶的活性。
強(qiáng)烈抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和結(jié)核桿菌，它主要抑制RNA合成的起始。
2、 利鏈菌素
與細(xì)菌RNA聚合酶β亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中鏈的延長(zhǎng)。
3、 α-鵝膏蕈堿
主要抑制真核RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，對(duì)細(xì)菌的RNA聚合酶作用極小。

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