P345  圖5-12  tRNA的二級結(jié)構(gòu)（三葉草模型）

1966年Crick對于tRNA能識別幾種密碼子的現(xiàn)象，提出堿基配對的“擺動學(xué)說”：
認(rèn)為除A-U、G-C配對外，還有非標(biāo)準(zhǔn)配對，I-A、I-C、I-U，并強調(diào)密碼子的5’端第1、2個堿基嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)配對，而第3個堿基可以非標(biāo)準(zhǔn)配對，具有一定程度的擺動靈活性。
四、 mRNA的結(jié)構(gòu)
mRNA是從DNA上轉(zhuǎn)錄而來的，其功能是依據(jù)DNA的遺傳信息，指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的生物合成，每一種蛋白質(zhì)都由一種相應(yīng)的mRNA編碼，細(xì)胞內(nèi) mRNA種類很多，大小不一，每種含量極低。
從功能上講，一個基因就是一個順反子，原核生物的mRNA是多順反子，真核mRNA是單順反子。
順反子：是由順反試驗所規(guī)定的遺傳單位，相當(dāng)于一種蛋白質(zhì)的基因。
1、 真核mRNA
（1）、 3’-端有一段約30-300核苷酸的polyA。
PolyA是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶對mRNA專一。
原核mRNA一般無polyA。polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA，其polyA較長；而衰老的mRNA，其polyA較短。
polyA功能：
PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。
PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。
（2）、 5’-帽子帽子
5’末端的鳥嘌呤N7被甲基化，鳥嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個核苷酸相連，形成5’-5’-磷酸二酯鍵。
P346   帽子結(jié)構(gòu)

帽子的功能：
可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。
可為核糖體提供識別位點，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。
2、 原核mRNA（多順反子）
原核mRNA由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5/帽子和3/polyA。
舉列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三個順反子，分別編碼A蛋白、外殼蛋白和復(fù)制酶三種蛋白質(zhì)。

          圖MS2病mRNA

5’端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5’-AGGAGGU-3’，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。
SD序列和核糖體16S的rRNA的3’末端富含嘧啶堿基的序列互補，這種互補序列與mRNA對核糖體的識別有關(guān)。
原核mRNA代謝很快，半壽期幾秒至十幾分鐘。
五、 rRNA的結(jié)構(gòu)
rRNA占總RNA的80%左右。
功能：rRNA是構(gòu)成核糖體的骨架，與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體，為蛋白質(zhì)的合成提供場所。
大腸桿菌中有三類rRNA（原核）
5S rRNA
16S rRNA
23S rRNA
真核細(xì)胞有四類rRNA
5S rRNA
5.8S rRNA
18S rRNA
28S rRNA

          圖  原核核糖體（rRNA 部分）

          圖   真核核糖體（rRNA部分）

P346  圖5-14   大腸桿菌  5S rRNA  結(jié)構(gòu)
第四節(jié)   核酸的性質(zhì)
一、 解離性質(zhì)
多聚核苷酸有兩類可解離的基團(tuán)：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。
磷酸是中等強度的酸，堿基的堿性較弱，因此，核酸等電點在較低的pH范圍內(nèi)。
DNA等電點  4—4.5
RNA 等電點 2—2.5
RNA鏈中，核糖C’2-OH的氫能與磷酸酯中的羥基氧形成氫鏈，促進(jìn)磷酸酯羥基氫原子的解離。
二、 水解性質(zhì)
1、 堿水解
室溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。
         圖

在相同條件下，DNA不被水解。這是因為RNA中C’2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。
DNA、RNA水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。
DNA穩(wěn)定 ，遺傳信息。
RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后降解。
2、 酶水解
生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶
RNA水解酶  RNase
DNA水解酶  DNase
核酸外一切酶
核酸內(nèi)切酶  最重要的：限制性核酸內(nèi)切酶
三、 光吸收性
堿基具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有強烈的光吸收，　　　　λmax=260nm
1、 鑒定純度
純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。
純RNA的A260/A280應(yīng)為2.0。
若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。
2、 含量計算
1 ABS值相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA
                  或：40ug/mL單螺旋DNA（或RNA）
                  或：20ug/mL核苷酸
3、 增色效應(yīng)與減色效應(yīng)
P347  圖5-15  DNA的紫外吸收光譜

增色效應(yīng)：在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大
減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。
四、 沉降特性（DNA）
不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心就可以將它們區(qū)分開來，這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。

      P348 圖5—16  Cs-Cl密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA

相對沉降常數(shù)
線型雙螺旋分子                1.00
松馳雙鏈閉環(huán)                  1.14
切刻雙鏈環(huán)                    1.14
單鏈環(huán)                        1.14
線型單鏈                      1.30
正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀        1.41
坍縮                          3.0

五、 變性、復(fù)性及雜交
變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對蛋白質(zhì)來說，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。這也是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。
1、 變性
（1）、 變性：
核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。多核苷酸骨架上共價鍵的斷裂稱核酸的降解。
DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。
P350  圖5-18變性過程

          熱變性
因素      酸堿變性（pH小于4或大于11，堿基間氫鍵全部斷裂）
           變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 
             260nm吸收值升高。
   變性后   粘度降低，浮力密度升高。
               二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活。  
（2）、 熔解溫度（Tm）或稱熔點：
DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時對應(yīng)的溫度。DNA的Tm一般在70—85℃之間。
濃度50ug/mL時，雙鏈DNA  A260=1.00，完全變性（單鏈）A260= 1.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半時，即1.185時，對應(yīng)的溫度即為Tm。
（3）、 影響DNA的Tm值的因素
①DNA均一性   均一性高，熔解過程發(fā)生在很小的溫度范圍
內(nèi)。
②G-C含量與Tm值成正比，G-C含量高，則Tm越高，測定Tm，可推知G-C含量。。
G-C%=（Tm-69.3）×2.44

P351圖5-19     圖5-20   Tm值與GC含量的關(guān)系
③介質(zhì)中離子強度
其它條件不變，離子強度高，Tm高。
P351    圖5-21
2、 復(fù)性
變性DNA在適當(dāng)（一般低于Tm20—25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
變性DNA在緩慢冷卻時（快速冷卻可防止復(fù)性），可以復(fù)性。DNA片段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度越大，復(fù)性越快。
復(fù)性速度可用Co·t衡量。
Co為變性DNA原始濃度mol·L-1，t為時間，以秒表示。

P352  圖5-22，不同DNA的復(fù)性時間。

A．1個核苷酸對（A.U）
圖上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L
若濃度為Co=1.0m mol/L
則復(fù)性50%所需時間t=0.004秒
若要全部復(fù)性，Cot=10-4  t=0.1秒
B．E.coli  4.2×106堿基對
圖上查出Cot1/2=10 mol.s/L
若濃度Co=1.0 umol/L則復(fù)性50%所需時間t=107秒，約115天。復(fù)性100%Cot=500 mol.s/L
t=5×108秒，5758天。
對于E.coli ，4.2×106bp，濃度達(dá)到umol/L級時，濃度已很高。 
復(fù)性機制：10-20bp成、拉鏈
3、 雜交（DNA—DNA、 DNA—RNA）
將不同來源的DNA混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復(fù)性。若這些異源DNA之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時會形成雜交分子。
第五節(jié) 核酸研究技術(shù)
一、 核酸的分離純化
要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。
       條件溫和，防止過酸、過堿。
      避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。
1、 DNA分離純化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性質(zhì)，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。
DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。
2、 RNA的制備（重點介紹mRNA的分離、純化）
用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。
去蛋白：鹽酸胍、苯酚等
必須防止RNA酶對RNA的破壞。
二、 核酸的凝膠電泳
1、 瓊脂糖電泳
① 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比
② 凝膠濃度
③ DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。
④ 電流，不大于5V/cm
2、 PAGE電泳
三、 限制性核酸內(nèi)切酶（1979年發(fā)現(xiàn)）
1、 限制修飾系統(tǒng)
         圖

2、 II型核酸內(nèi)切酶
核酸內(nèi)切酶有I、II、III三種類型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。
II型酶的特點：限制和修飾活性分開，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子Mg2+，位點序列旋轉(zhuǎn)對稱（反向重復(fù)）。
II型酶的切割頻率
識別位點 4       44=256
                6       46=4096
                8       48=65536

Not I    GCGGCCGC
限制酶的命名：E.coRI
第一位：      屬名E（大寫）
第二、三位：  種名的頭兩個字母小寫co
第四位：      菌株R
第五位：      羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來的這一類酶的編號。
同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。
BamH：  GGATCC       同裂酶 BstI
識別位點相同，切割位點相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。
同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。
BamHI：GGATCC
同裂酶：BstI GGATCC

同尾酶：BclI  TGATCA   BglII  AGATCT

MboI  GATC    Sau3A  GATC
星號活力：在一定條件下（低離子強度，堿性pH，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會發(fā)生變化。

例如  HindIII   AAGCTT

四、 DNA物理圖譜及構(gòu)建
（限制酶切圖譜、DNA酶切位點圖譜）
在研究某一種DNA時，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此DNA的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建DNA物理圖譜：
（1）單酶完全降解和部分降解
（2）雙酶降解

         圖
五、 分子雜交
1、 Southern Blotting
P353 圖5-23
DNA樣品        酶切         電泳           變性         轉(zhuǎn)膜          固定         雜交           洗滌              放射自顯影
變性（NaOH 0.5mol/L）
轉(zhuǎn)膜（NC膜）
固定（80℃，4-6h）
雜交（高鹽濃度，68℃，幾小時）
Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。
可用DNA或RNA探針。
2、 Northern Blotting
研究對象是mRNA
檢測可與探針DNA同源雜交的mRNA分子的存在，因而可以研究細(xì)胞內(nèi)特定mRNA的產(chǎn)生，即特定基因的表達(dá)。
mRNA易形成局部二級結(jié)構(gòu)，因此，總RNA或mRNA需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二級結(jié)構(gòu)。
3、 Western Blotting
是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。
六、 DNA序列分析
（一） 化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert 法）
DNA一級結(jié)構(gòu)測定原理：
利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長度只差一個核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長度只差一個核苷酸DNA片段的PAGE上分離。
一定濃度的特測片段
                       32P-GCTACGTA
特異性化學(xué)裂解
在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT
在G處：32p-GCTA
在C處：32P-G和 32P-GCTA
在T處：32P-GC和32P-GCTACG
        圖

硫酸二甲酯特異切割：G
甲酸特異切割：G和A
肼在Nacl條件下切割：C
肼在無 Nacl條件下切割：T和C
32P *ACTTCGACAA
硫酸二甲酯：   *ACTTC
甲酸：         *P
               *ACTTC
*ACTTCG
*ACTTCGAC
                *ACTTCGACA
肼（有Nacl）：  *A
               *ACTT
               *ACTTCGA
肼（無Nacl）：  *A    
*AC   
*ACT
                *ACTT
*ACTTCGA
從下往上讀：CTACGTA
末端G不能讀出。
（二） 雙脫氧終止法
英國   Sanger
     1955  確定牛胰島素結(jié)構(gòu)
     1958  獲諾貝爾化學(xué)獎
     1980  設(shè)計出DNA測序法
     1980  再獲諾貝爾化學(xué)獎
合成一段與待測DNA序列互補的DNA片段群。
         圖

胰島素的基因工程：A鏈21a.a   63個核苷酸
                  B鏈30a.a   90個核苷酸
（三） 序列分析儀
四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的ddNTP
七、 DNA合成（合成探針、引物、基因）
1、 化學(xué)合成——DNA合成儀
DNA固相合成（亞磷酸三酯法）
合成方向：3’        5’端
5’-OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)，
堿基上氨基用苯甲酸保護(hù)
3’-OH用氨基磷酸化合物活化

P353  合成過程

保護(hù)： 5’-OH、活化3’-OH、保護(hù)所有NH2
2、 DNA的酶合成——PCR
用DNA聚合酶I
必備條件：
①模板DNA（單鏈）
②引物
③DNA聚合酶
④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP
⑤一定濃度的Mg2+
鏈合成方向：5  ’      3’端
新的DNA鏈合成，從引物DNA的3’-OH開始。
          圖

鏈的增長反應(yīng)是引物DNA的3’-OH，對脫氧核糖核苷三磷酸的α-磷原子親核進(jìn)攻的結(jié)果。
化學(xué)合成：方向3’     5’，不需DNA模板，不用酶。
生物合成：方向5’     3’，需模板，引物，用酶。

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