圖P111 下  肽鍵結構

結構１中，Ｃ－Ｎ單鍵長0.148nm
結構２中，Ｃ＝Ｎ雙鍵長０.127nm
結構３中，Ｃ--Ｎ鍵長0.132nm，６個原子幾乎處在同一平面內（酰氨平面）。
肽鍵結構介于１和２之間（結構3），是結構1和結構2之間的平均中間狀態(tài)。Ｃ－Ｎ單鍵具有的40%的雙鍵性質，C═O雙鍵具有40%的單鍵性質。
（3）肽鍵亞氨基在pH0---14內不解離。
（4）肽鏈中的肽鍵一般是反式構型，而Pro的肽鍵可能出現(xiàn)順、反兩種構型．

圖

二、 肽的重要性質
1、 旋光性
一般短肽的旋光度等于其各個氨基酸的旋光度的總和。蛋白質水解得到的各種短肽，只要不發(fā)生消旋作用，也具有旋光性。
2、 肽的酸堿性質
短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。
在pH0―14范圍內，肽鍵中的亞氨基不解離，因此肽的酸堿性質主要取決于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及側鏈Ｒ上可解離的基團。
在長肽或蛋白質中，可解離的基團主要是側鏈基團。
肽中的末端α－COOH pK值比游離 a.a中的大一些，而末端α－Ｎ＋Ｈ３的pK值比游離氨基酸中的小一些，R基變化不大。
pK值改變的原因：
見Ｐ113、表３－８，比較表３－８中Gly-Gly和Gly-Gly-Gly

Gly—Glu—Lys—Ala的解離：

圖   P113

pH    占優(yōu)勢離子的凈電荷：
<3.5         +2
3.5-4.5        +1
4.5-7.8         0
7.8-10.2       -1
>10.2         -2
注意：占優(yōu)勢離子的凈電荷不是全部離子的平均凈電荷。

問題1：求出二肽Lys—Lys 及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。

圖

將Ｒ＋＋— 變成Ｒ＋—，就必須考慮R＋—與R（+  ，+  ，-1）等同，即側鏈—N+H3解離50%，此時
圖

Lys-Lys-Lys分子中有三個側鏈可解離，它的R+-實際相對于R（+    ，+   ，+     ， -1  ），此時每個側鏈解離后帶有 1/3個正電荷。

問題2：把一個氨基酸結晶加入pH7.0的純水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 還是等于6.0？ （小于6.0）

多肽的等電點，隨著肽鏈內酸性氨基酸殘基數(shù)的增加而下降，隨著肽鏈內堿性氨基酸殘基數(shù)的增加而上升。
多肽的等電點可以通過計算求得（如上例中），但殘基數(shù)增大時，此法不行�？蓪㈦逆渻人嵝詺埢�和堿性殘基進行清點比較，推測等電點偏酸還是偏堿，然后用等電點聚焦電泳進行實驗測定。
3、 肽的化學反應
和游離氨基酸一樣，肽的α—羧基，α—氨基和側鏈R基上的活性基團都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應。
凡是有肽鍵結構的化合物都會發(fā)生雙縮脲反應，且可用于定量分析。雙縮脲反應是肽和蛋白質特有的反應，游離氨基酸無此反應。

圖

三、 天然存在的活性肽
生物體內存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很強的生物活性，稱活性肽。
生物的生長、發(fā)育、細胞分化、大腦功能、免疫、生殖、衰老、病變等都涉及到活性肽。
活性肽是細胞內部、細胞間、器官間信息溝通的主要化學信使。
很多激素、抗生素都屬于肽類或肽的生物。
1、 谷胱甘肽    Glu—Cys—Gly
廣泛存在于動、植、微生物細胞內，在細胞內參與氧化還原過程，清除內源性過氧化物和自由基，維護蛋白質活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。
   2GSH              GS—SG

   H2O2 + 2GSH           2H2O + GS—SG
2、  短桿菌肽（抗生素）
由短桿菌產(chǎn)生的10肽環(huán)。抗革蘭氏陽性細菌，臨床用于治療化濃性病癥。

     L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe —L-Pro—L-Val
3、 腦啡肽（5肽）
已發(fā)現(xiàn)幾十種
      Met--- 腦啡肽：  Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
      Leu----腦啡肽：   Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
具有鎮(zhèn)痛作用。

1982年，中科院上海生化所用蛋白質工程技術合成了Leu---腦啡肽，既有鎮(zhèn)痛作用又不會象嗎啡那樣使人上癮。
     《神經(jīng)生物化學》 神經(jīng)多肽
生物體內多肽或寡肽的來源：
①合成蛋白質的剪切、修飾
②酶專一性逐步合成（如谷胱甘肽）、
③動物腸道可吸收寡肽
第四節(jié) 蛋白質的一級結構（共價結構）
蛋白質的一級結構也稱共價結構、主鏈結構。
一、 蛋白質結構層次
                一級結構（氨基酸順序、共價結構、主鏈結構）
                    ↓   是指蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序
                 二級結構
                        ↓
                    超二級結構
                        ↓
構象（高級結構）     結構域
                    ↓
                  三級結構(球狀結構)
                    ↓
                  四級結構(多亞基聚集體)

一級結構：共價結構、蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序(含二硫鍵)
二級結構：多肽鏈主鏈中各個肽段形成的規(guī)則的或無規(guī)則的構象。主要有α-螺旋、β折疊、β-轉角、無規(guī)卷曲。
超二級結構：由兩個以上二級結構單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級結構的組合體如αα、βαβ、βββ。
結構域：大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個緊密的球狀構象，彼此分開，以松散的肽鏈相連，此球狀構象是結構域，結構域是多肽鏈的獨立折疊單位，一般由100-200個氨基酸殘基構成。
三級結構：多肽鏈通過盤旋、折疊，形成緊密的借各種次級鍵維持的球狀構象。
或：蛋白質分子或亞基內所有原子的空間排布，不含亞基間或分子間的空間排列關系。
四級結構：寡聚蛋白中亞基種類、數(shù)目、空間排布及亞基間相互作用力。
單鏈蛋白質只有一、二、三級結構，無四級結構。

                                
                                       RNase
                          單條肽鏈     肌紅蛋白
               單體蛋白                胰島素
                          多條肽鏈     胰凝乳蛋白酶
      蛋白質                      
                            相同亞基 一種乳酸脫氫酶α4
             
                寡聚蛋白        
                             不同亞基 血紅蛋白α2β2

蛋白質一級結構(序列)中含有形成高級結構的全部需的信息，一級結構決定高級結構結構及功能。

二、 一級結構的要點
蛋白質主鏈由氨基酸以酰胺鍵連接，多肽的線性結構叫肽鏈，組成肽鏈的氨基酸叫氨基酸殘基。
一級結構要點：
⑴蛋白質中的肽鍵都是由α-NH2和α-COOH結合生成的。
⑵每一種蛋白質都有相同的肽主鏈結構，各種蛋白質間的差異是蛋白質的氨基酸種類、數(shù)量及排列順序不同。
⑶氨基酸的α-NH2和α-COOH縮合，只有末端及側鏈基團有化學活性。
⑷每個蛋白質或每個蛋白質的亞基只有一個α-NH2 和α-COOH
⑸分子量大于5000的活性肽才能稱為蛋白質。                             
三、 ．蛋白質一級結構測定
                      推斷                       預測
氨基酸序列（一級結構）  →  空間結構 （高級結構）  → 功能    
（一） 蛋白質測序的一般步驟
祥見 P116
（1） 測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目。
（2） 拆分蛋白質分子中的多肽鏈。
（3） 測定多肽鏈的氨基酸組成。
（4） 斷裂鏈內二硫鍵。
（5） 分析多肽鏈的N末端和C末端。
（6） 多肽鏈部分裂解成肽段。
（7） 測定各個肽段的氨基酸順序
（8） 確定肽段在多肽鏈中的順序。
（9） 確定多肽鏈中二硫鍵的位置。
（二） 蛋白質測序的基本策略
對于一個純蛋白質，理想方法是從N端直接測至C端，但目前只能測60個N端氨基酸。
1、 直接法（測蛋白質的序列）
兩種以上特異性裂解法
              N                          C
      A 法裂解  A1    A2     A3     A4    
      B 法裂解  B1    B2     B3     B4 

用兩種不同的裂解方法，產(chǎn)生兩組切點不同的肽段，分離純化每一個肽段，分離測定兩個肽段的氨基酸序列，拼接成一條完整的肽鏈。
2、 間接法（測核酸序列推斷氨基酸序列）
核酸測序，一次可測600-800bp
（三） 測序前的準備工作
1、 蛋白質的純度鑒定
純度要求，97%以上，且均一，純度鑒定方法。（兩種以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法測N端氨基酸
2、  測定分子量
        用于估算氨基酸殘基n=

方法：凝膠過濾法、沉降系數(shù)法
3、 確定亞基種類及數(shù)目
多亞基蛋白的亞基間有兩種結合方式：
⑴非共價鍵結合
8mol/L尿素，SDS        SDS-PAGE測分子量  
⑵二硫鍵結合
        過甲酸氧化：
         —S—S—+HCOOOH  →   SO3H
      β巰基乙醇還原：

舉例:： 血紅蛋白 (α2β2)
        （注意，人的血紅蛋白α和β的N端相同。）
            分子量：  M
            拆亞基：  M1 、M2       兩條帶
          拆二硫鍵：  M1 、M2       兩條帶
      分子量關系：  M = 2M1 + 2M2
4、 測定氨基酸組成
主要是酸水解，同時輔以堿水解。氨基酸分析儀自動進行。
確定肽鏈中各種a.a出現(xiàn)的頻率,便于選擇裂解方法及試劑。
①Trp測定
     對二甲基氨基苯甲醛  590nm。
②Cys 測定
     5、5/一二硫代雙（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm
5、 端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。無色PTH-氨基酸，有機溶劑抽提，層析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH     無水肼NH2NH2  100℃  5-10h。
                               
                          A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、  D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能測）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
        N   H2N… … … … …Val—Ser—Gly   C

圖 P118  羧肽酶法測C末端

（四） 肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化
1、 化學裂解法
       ①溴化氰              —Met—X—   產(chǎn)率85%
       ②亞碘�；�苯甲酸      —Trp—X—   產(chǎn)率70-100%
       ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
       ④羥胺NH2OH         —Asn—Gly—
        約150個氨基酸出現(xiàn)一次
2、 酶法裂解
①胰蛋白酶         Lys      X
    (X ≠ Pro)          
                      Arg—— X

②胰凝乳蛋白酶     Tyr——X
     (X ≠ Pro)       
                      Trp——X

                      Phe——X

胃蛋白酶
                   Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)

③Glu蛋白酶       Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶       Arg——X

⑤Lys蛋白酶       X——Lys

⑥Pro蛋白酶       Pro——X
3、 肽段的分離純化
①電泳法   ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
        根據(jù)分子量大小分離
②離子交換層析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
        根據(jù)肽段的電荷特性分離
③反相ＨＰＬＣ法
        根據(jù)肽段的極性分離
④凝膠過濾
4、 肽段純度鑒定
分離得到的每一個肽段，需分別鑒定純度，常用ＤＮＳ－c l法
要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ單帶、ＨＰＬＣ單峰、Ｎ端單一。
（五） 肽段的序列測定及肽鏈的拼接
1、 Edman法
一次水解一個Ｎ端a.a
（1）耦聯(lián)
        PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃      PTC——A-B-C-D……

（2）裂解
        PTC—A-B-C-D……TFA無水三氟乙酸        ATZ—A  +  H2N—B-C-D

（3）轉化
        ATZ—A                  PTH—A
           用GC或HPLC測定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙內酰硫脲（一氨基酸）
                    耦聯(lián)：得PTC肽
        一次循環(huán)    裂解：ATZ- a.a
                    轉化：PTH-a.a
        反應產(chǎn)率   99％   循環(huán)次數(shù)    120
        (偶聯(lián)、降  98%                60
        解兩步）   90%                40
2、 DNS-Edman法
用DNS法測N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
       Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
       圖
3、 有色Edman法
熒光基團或有色試劑標記的PITC試劑。
4、 用自動序列分析儀測序
儀器原理：Edman法，可測60肽。
1967液相測序儀
               自旋反應器，適于大肽段。
1971固相測序儀
              表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。
1981氣相測序儀
              用Polybrene反應器。
       （聚陽離子）四級銨鹽聚合物
        液相：5nmol    20-40肽    97%
        氣相：5pmol     60 肽     98%
5、 肽段拼接成肽鏈
16肽，Ｎ端H    Ｃ端Ｓ
        Ａ法裂解：ONS  PS  EOVE  RLA  HOWT
        Ｂ法裂解：SEO  WTON  VERL  APS  HO
重疊法確定序列：HOWTONSEOVER LAPS
（六） 二硫鍵、酰胺及其他修飾基團的確定
1、 二硫鍵的確定（雙向電泳法）
碘乙酰胺封閉-SH
胃蛋白酶酶解蛋白質
第一向電泳
過甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向電泳
分離出含二硫鍵的兩條短肽，測序
與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。
2、 酰胺的確定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個Asx或Glx的肽，用電泳法確定是Asp還是Asn
舉例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 時，電荷量是  Leu+    Pro0    Val-
        此肽除Glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gln。
3、 糖、脂、磷酸基位置的確定
糖類通過Asn、Ser與蛋白質連接，-N-糖苷  -0-糖苷
脂類：Ser、 Thr、Cys
磷酸：Ser、 Thr、His
經(jīng)驗性序列：  Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
四、 蛋白質的一級結構與生物功能
（一） 蛋白質的一級結構決定高級結構和功能
蛋白質一級結構舉例：
（1） 牛胰島素
Sanger于1953年首次完成測序工作。
P128  圖3-38
分子量：5700 dalton
51個a.a殘基，A鏈21個殘基，B鏈30個殘基，
A鏈內有一個二硫鍵 Cys 6—Cys 11
A.B鏈間有二個二硫鍵           A.Cys 7 — B Cys 7
                               A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）

P128 圖3-39
分子量：12600
        124個a.a殘基
        4個鏈內二硫鍵。

牛胰RNase變性一復性實驗：
P164    圖3-69。

(8M尿素+β硫基乙醇)變性、失活→透析，透析后構象恢復，
活性恢復95%以上，而二硫鍵正確復性的概率是1/105。

（3）人血紅蛋白α和β鏈及肌紅蛋白的一級結構 

P129  圖3-40

（二） 同源蛋白質一級結構的種屬差異與生物進化
同源蛋白質：在不同的生物體內具有同一功能的蛋白質。如：血紅蛋白在不同的脊椎動物中都具有輸送氧氣的功能，細胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。
同源蛋白質的特點：
①多肽鏈長度相同或相近
②同源蛋白質的氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。
③除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個別氨基酸的變化不影響蛋白質的功能。
通過比較同源蛋白質的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關系和進化，親源關系越遠，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。
1、 細胞色素C
存在于線粒體膜內，在真核細胞的生物氧化過程中傳遞電子。

P130，圖3-41
分子量：12500左右
氨基酸殘基：100個左右，單鏈。
25種生物中，細胞色素C的不變殘基35個。
60種生物中，細胞色素C的不變殘基27個。
親源關系越近的，其細胞色素C的差異越小。
親源關系越遠的，其細胞色素C的差異越大。
人與黑猩猩         0
人與猴             1
人與狗             10
人與酵母           44
2、 胰島素
祥見 P175  胰島素的結構與功能

不同生物的胰島素a.a序列中，有24個氨基酸殘基位置始終不變，
A．B鏈上6個Cys 不變（重要性），其余18（24-6）個氨基酸多數(shù)為非極性側鏈，對穩(wěn)定蛋白質的空間結構起重要作用。
其它氨基酸 對穩(wěn)定蛋白質的空間結構作用不大，但對免疫反應起作用，豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。
（三） 蛋白質一級結構的個體差異—分子病
分子病：基因突變引起某個功能蛋白的某個（些）氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導致整個分子的三維結構發(fā)生改變，致使其功能部分或全部喪失。
Linus Pauling首先發(fā)現(xiàn)鐮刀形紅細胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的，成人的血紅蛋白是由兩條相同的a鏈和兩條相同的b鏈組成a2b2，鐮刀形紅細胞中，血紅蛋白b鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val。因此，當血紅蛋白沒有攜帶O2時就由正常的球形變成了剛性的棍棒形，病人的紅細胞變成鐮刀形，容易發(fā)生溶血作用(血細胞溶解)導致病血，棍棒形的血紅蛋白對O2的結合力比正常的低。
以血紅蛋白為例：α2β2寡聚蛋白
正常人血紅蛋白，β.N......Glu 6
鐮刀型貧血      β.N......Val 6
生理條件下電荷：
Va10      Glu-
疏水     親水
人的血紅蛋白分子的四條肽鏈中（574個氨基酸殘基）只有兩個Glu分子變化成Va1分子，就能發(fā)生鐮刀狀細胞貧血病。
（四） 一級結構的部分切除與蛋白質的激活
一些蛋白質、酶、多肽激素在剛合成時是以無活性的前體形式存在，只有切除部分多肽后才呈現(xiàn)生物活性，如血液凝固系統(tǒng)的血纖維蛋白原和凝血酶原，消化系統(tǒng)的蛋白酶原、激素前體等。
1、 血液凝固的機理
                    凝血因子（凝血酶原致活因子）

凝血酶原                   凝血酶
                 
   纖維蛋白原A                    纖維蛋白B         凝膠
（1）、 凝血酶原

P133  圖3-43  凝血酶原的結構糖蛋白，分子量66000，582個a.a殘基，單鏈。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324斷裂，釋放出274個a.a，產(chǎn)生活性凝血酶。
            A鏈49 a.a
         B鏈259 a.a
（2）、 纖維蛋白原

P133   圖3-44  纖維蛋白原的結構

α2β2r2
α肽：600個氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410個氨基酸
在凝血酶作用下，從二條α鏈和二條β鏈的N端各斷裂一個特定的肽鍵-Arg—Gly-，釋放出二個纖維肽A（19個氨基酸）和二個纖維肽B（21個氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。

P133   纖維肽A .B的結構

A、B肽切除后，減少了蛋白質分子的負電荷，促進分子間聚集，形成網(wǎng)狀結構。

P134上

在凝血因子XIIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質單體間形成共價�。℅ln-Lys結合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。
2、 胰島素原的激活
P134圖3-45

胰島素在胰島的β細胞內質網(wǎng)的核糖體上合成，稱前胰島素原，含信號肽。前胰島素原在信號肽的引導下，進入內質網(wǎng)腔，進入后，信號肽被信號肽酶切除，生成胰島素原，被運至高爾基體貯存。并在特異的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰島素。
五、 多肽與蛋白質的人工合成
在醫(yī)藥和研究方面意義重大
1958年，北大生物系合成催產(chǎn)素8肽。
1965年，中國科學院生化所、有機所、北大化學系人工合成牛胰島素。
1969年，美國Merrifield用自動化的固相多肽合成儀合成第一個酶——牛胰RNase（124aa—）。

P139圖3-46  多肽的固相合成

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